一、应用PCR及Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原研究（论文文献综述）
刘晓彬[1]（2019）在《广西柳州市柑橘黄龙病综合防控存在的问题及对策研究》文中进行了进一步梳理柑橘产业是柳州市农业的主导产业之一,近年来柑橘产业发展较快,2018年柳州市柑橘种植面积约5.7万公顷,种植面积和产量均占水果总量的77%左右,主要品种包括蜜桔、砂糖橘、金桔、椪柑、橙类、柚类等。柑橘黄龙病是影响柳州市柑橘产业发展的主要因素之一。因此,加强对柳州市柑橘黄龙病综合防控存在的问题及对策研究十分必要且迫切。针对柑橘黄龙病尚无特效治疗药剂,也没有抗（耐）病品种可供使用。“防木虱、砍病树、种无病苗”（俗称“三板斧”）是目前最为有效的防治手段。本文根据国内外研究现状,总结分析了当前柑橘黄龙病的主要防治手段及其优缺点。通过查阅资料,了解柳州市柑橘黄龙病发生概况,重点对柳州市柑橘黄龙病综合防控示范区建设情况进行分析,总结近年来柳州市开展柑橘黄龙病综合防控的主要做法,分析存在的问题,主要包括政策法规执行力度不足、缺乏高效的组织管理职能、财政投入仍不足且资金到位较晚、全面开展普查难度大、无病苗木繁育体系建设起步晚、柑橘苗木市场监管仍不到位、不能及时高效清除病树、缺乏高素质的专业化种植管理队伍等。探究应对柳州市柑橘黄龙病综合防控存在问题的对策,从法律保障、政策保障、财政保障、技术保障、示范建设等方面提出对策,以期建立起柑橘黄龙病防控长效机制,有效控制黄龙病所带来的严重危害,维持果园在较低黄龙病发病水平条件下实现较长时期正常投产,并获得较好的经济效益。
李彬[2]（2019）在《柑橘黄龙病快速检测技术研制及应用》文中指出柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是世界柑橘生产上极具毁灭性的病害。我国至今尚无有效的药剂可用于根治黄龙病,也未见报道选育出可靠的抗病品种和砧木,主要以挖除病树、防控柑橘木虱、使用无病苗木的手段来防控黄龙病。因此,柑橘苗木带病情况及大田植株感病情况的快速检测对有效防控柑橘黄龙病尤为重要。柑橘黄龙病的检测方法主要有常规PCR、巢式PCR、定量PCR、显微镜观察、血清学诊断、光谱检测等。由于柑橘黄龙病菌具有多样性,前人报道的柑橘黄龙病病原菌抗体多数均只能与相似的抗原结合,不能广泛地应用于不同区域、不同品种的柑橘黄龙病检测。环介导等温扩增（LAMP）技术相比于传统的检测方法,更省时省力,节约检测成本。因此,本论文针对广西柑橘黄龙病病原开展了多克隆抗体的研究,同时建立柑橘黄龙病可视化LAMP体系并对广西部分地区的柑橘苗木和田间植株进行黄龙病检测。主要研究结果如下:（1）根据NCBI数据库中多条柑橘黄龙病病原菌外膜蛋白omp基因,设计特异引物克隆目的片段并构建原核表达载体pET32a-omp1,将其质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中进行重组蛋白诱导表达。在优化后的条件下（添加诱导剂IPTG0.6 mM,在37℃下诱导表达5 h）诱导得到大量以包涵体形式表达的重组蛋白。经Western Blot验证,成功获得约55kDa的重组蛋白。将该重组蛋白进行纯化（纯度≥90%）后作为抗原,制备柑橘黄龙病病菌omp多克隆抗体,最终得到效价超过1:512 K的多克隆抗体（2）利用PrimerExplorer V5在线软件在柑橘黄龙病病原菌16SrDNA序列保守区域的6个位点设计LAMP引物,对LAMP反应体系与反应条件进行优化得到Mg2+6 mM,dNTP 1.2 mM,FIP/BIP 1.6 μM,F3/B3 0.2 μM,B.st DNA聚合酶大片段0.24 U/μL,1O×ThermoPol 2.5μL,0.2%Tween-20为最佳反应体系,65℃反应50 min,80℃灭活7 min为最优反应条件,添加1μL10倍稀释的SYBR Green I核酸染料显色观察反应结果。建立的LAMP体系仅对黄龙病基因进行扩增,特异性高。将感染柑橘黄龙病植株叶脉总DNA倍比稀释后作为模板检测灵敏度,LAMP检测下限可达2.18ng/μL,高于常规PCR检测100倍,与荧光定量PCR相当。应用常规PCR和建立的可视化LAMP检测方法对广西部分地区的不同品种柑橘苗木和田间植株进行黄龙病检测。网室培育的25株香橙砧木和25株香橙砧金秋砂糖桔嫁接苗,均未检测出柑橘黄龙病菌;田间植株155株,柑橘黄龙病LAMP检测方法检出的阳性率为13.6%,常规PCR检测方法的阳性率为11.6%,常规PCR检测结果为阳性的样品在LAMP检测结果中均为阳性,建立的LAMP体系可用于广西柑橘黄龙病田间样品与苗木的快速检测。
肖怀春[3]（2019）在《基于高光谱成像技术的柑橘黄龙病诊断方法研究》文中研究说明柑橘黄龙病是柑橘生产中最具毁灭性的病害之一,极大地制约了柑橘产业的健康持续发展。目前尚未研制出治疗黄龙病的有效药剂,只能尽早发现病树,予以移除,避免病害的进一步传播。故及时准确检测柑橘黄龙病,在控制其蔓延、保障柑橘产业的健康发展方面,具有重要的现实意义。当前,传统的黄龙病检测方法需破坏样品、成本高、周期长,很难在实际生产中普及应用。利用高光谱成像技术,研究柑橘染病叶片主要理化性状的光谱和图像响应特性,探索一种无损、精准的柑橘黄龙病检测方法,为高光谱成像技术应用于精准农业领域提供支持。本论文的主要研究内容如下:1.阐明了基于高光谱成像技术的柑橘黄龙病无损检测机理,分析了3类不同病害程度柑橘叶片主要理化指标含量的变化规律。即理化指标含量变化与光谱吸收之间存在一定线性关系:正常叶片叶绿素含量均值最高,缺素叶片最低;而黄龙病叶片可溶性糖和淀粉含量均值较正常叶片高,分别为31.23±12.81和9.24±3.71 mg/g。2.运用现代科学仪器和实验分析方法,研究了图像感兴趣区域选取、光谱预处理方法和光谱特征变量等对柑橘染病叶片光谱判别模型的影响。得出了图像最佳的感兴趣区域位于叶片叶脉左侧中间且像素面积大小为100个,同时二阶导的预处理方法结合连续投影算法选择光谱特征变量最好。研究表明连续投影算法选择27个变量的偏最小二乘判别模型对正常、轻度黄龙病、中度黄龙病、重度黄龙病和缺素5类叶片判别效果最优,误判率为5%。3.探索了基于光谱信息的柑橘黄龙病叶片叶绿素、可溶性糖和淀粉的无损检测方法,建立了线性和非线性数学模型。研究得出730 nm处黄龙病叶片的光谱特征峰值低于正常叶片。结果表明组合样品构成的建模集结合二阶微分光谱构建数学模型可用于预测3项理化指标。线性模型预测结果最佳,叶绿素、可溶性糖和淀粉指标的模型相关系数分别为0.86、0.74和0.82,预测均方根误差分别为8.86、9.75和1.42。4.提出了可用于柑橘染病叶片可视化判别的分块灰度共生矩阵算法,提取了柑橘黄龙病识别敏感的特征波长,建立了基于纹理特征的判别模型。结果显示SPA提取9个光谱特征波长下图像纹理特征的PLS-DA模型效果最好,误判率最低为3.12%。构建基于MB-GLCM的可视化判别模型,实现了柑橘黄龙病可视化诊断。
唐利华,郭堂勋,李其利,黄穗萍,莫贱友[4]（2018）在《柑橘黄龙病田间诊断与检测技术研究进展》文中研究表明目前防控柑橘黄龙病的措施主要包括培育无病毒苗、防治木虱、铲除病树等。而多数防控措施的开展均需灵敏、可靠的早期诊断技术配合。综述了柑橘黄龙病的田间诊断方法以及基于电镜、血清学、高光谱、淀粉显色、常规PCR、巢式PCR、LAMP PCR、定量PCR、数字PCR的检测方法 ,并阐述了各自的优缺点。其中,定量PCR是目前较成熟和具有较高灵敏度的检测技术,可配合其他低成本检测方法对未显症、假阴性等样品进行早期检测;可实现单分子DNA绝对定量分析,数字PCR检测技术在柑橘黄龙病检测中也具有较好的应用前景。
丁鹏[5]（2018）在《柑橘黄龙病PCR检测和近红外技术快速检测方法的建立与应用》文中研究指明柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是世界柑橘产业检疫性病害,亦是最具毁灭性的柑橘病害之一。HLB肆虐于全球的众多柑橘产区,严重制约柑橘产业健康发展。HLB常导致柑橘植株树势衰退、叶片斑驳型黄化、均匀型黄化、缺素型黄化和“红鼻果”病状。HLB病原是一种韧皮部杆菌属中的革兰氏阴性菌,根据16SrDNA基因序列、地理来源及热敏感性,病原细菌可分为韧皮部杆菌亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas）,韧皮部杆菌非洲种（Candidatus Liberibacter africanus,CLaf）,韧皮部杆菌美洲种（Candidatus Liberibacter americanus,CLam）三个种。因病原菌尚不能纯培养,至今未完成科赫氏原则验证,所以对该病害的深入研究面临严峻挑战。HLB可通过运输带毒苗木、嫁接带毒接穗的方式进行远距离传播,也可以通过媒介昆虫柑橘木虱近距离传播。由于HLB的传播特性以及暂无有效药剂等原因,给柑橘HLB的防控造成极大困难。HLB的防控措施主要是清除病树、种植无病毒苗木和防控柑橘木虱,因此开展柑橘HLB的快速、准确检测研究具有重要意义。本文从以下三方面进行了研究:比较研究了3种提取单头柑橘木虱体内HLB病原菌DNA的方法,为快速、准确检测昆虫体内病原菌提供技术支持;对目前常用的四种制样方法:CTAB-Trion法、磁珠法、裂解法和浸提法的核酸提取效果、操作步骤以及成本等方面开展分析比较,并结合环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）联用检测,筛选出一种适合大规模柑橘样品HLB检测的制样方法;基于近红外技术柑橘HLB快速检测方法的建立与应用,为田间快速诊断病害提出新的解决思路。以上研究取得研究结果如下:1、对已报道的裂解法和氯仿-异戊醇法以及试剂盒法进行了比较研究,发现3种方法均可以成功提取到单头柑橘木虱总核酸并可用于HLB的PCR检测,但在提取的核酸质量、操作步骤及简易程度、耗时及成本等方面存在差异:核酸质量方面,氯仿-异戊醇法最佳,裂解法和试剂盒法较差;操作步骤及简易程度方面,裂解法和试剂盒法优于氯仿-异戊醇法;耗时方面,裂解法和试剂盒法耗时远远少于氯仿-异戊醇法;成本方面,氯仿-异戊醇法和试剂盒法高于裂解法。2、对四种制样方法:CTAB-Trion法、磁珠法、裂解法和浸提法的制备步骤、核酸质量、耗时、成本以及环保等方面展开评价,并把四种方法获得的核酸与柑橘HLB的LAMP检测技术联用,结果表明:CTAB-Trion法和磁珠法提取的核酸质量最好,其OD260/OD280值在1.8-2.0之间,满足柑橘HLB LAMP检测,但操作步骤繁琐、复杂,成本、耗时较高且CTAB-Trion法需使用苯酚和氯仿试剂;裂解法提取的核酸质量虽不高,但可满足LAMP扩增,同时其操作步骤极少且易,成本低、耗时少,相对环保;浸提法提取的核酸量少、质量差,无法满足LAMP扩增要求。裂解法是柑橘HLB LAMP检测的最佳制样方法,满足大规模柑橘样品的HLB检测要求。3、基于近红外技术检测柑橘HLB的研究中发现:特征图谱显示近红外可用于HLB检测,最佳的判别分析算法是偏最小二乘法-线性判别分析法,理想的光谱信息预处理方法为多元散射校正,使用优化后的模型检测720份田间脐橙叶片的检测结果与常规PCR检测结果符合率可达91%。
陈俊甫[6]（2018）在《韧皮部杆菌与植原体在长春花上互作关系的初步研究》文中进行了进一步梳理柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing,HLB）是柑橘生产上最具毁灭性的病害之一,对全球柑橘产业造成巨大的经济损失。该病害普遍认为是由原核生物、薄壁菌门、α-变形菌纲（Proteobacteriacea）的韧皮部杆菌属（“Candidatus Liberibacter spp.”）所引起,但该病原尚不能进行人工培养,未能完成柯赫氏法则。早期的研究发现在感染黄龙病的柑橘植株内可以同时检测到韧皮部杆菌（“Candidatus Liberibacter asiaticus”,CLas）和植原体（“Candidatus phytoplasma asteri”,CPa）,但关于二者的关系尚不清楚。目前,实时荧光定量PCR技术已广泛用于CLas的检测,而用于CPa的检测还未有报道,本研究基于CPa的16S rDNA核酸序列的特异序列区域,设计特异性检测CPa的引物。本研究利用难培养菌的指示植物长春花（Catharanthus roseus）为实验材料,通过比较感染CLas的长春花的不同组织的嫁接传病率来探索传病效率更高、传病速度更快的嫁接方式;采用分别含CLas和CPa的嫁接材料结合不同嫁接组合的方法比较两种病原在长春花上的嫁接传病速度,转移方向,病原菌增殖、分布的情况来探索它们之间的互作关系。叠氮溴化锭（Ethidium Monoazide Bromide,EMA）是一种特异性核酸染料,有选择性的进入死细胞内与其DNA紧密结合形成共价复合物,使得DNA不能进行PCR扩增。本研究利用EMA-PCR检测技术对染病长春花和柑橘的不同发病时期叶片的活菌含量进行测定分析,便于更准确的掌握染病植株叶片不同发病时期CLas的活菌含量。取得的主要研究结果如下:1、将柑橘黄龙病相关菌CPa的16S rDNA核酸序列与6个其他植原体以及植物叶绿体16S rDNA序列进行比对分析,基于CPa的16S rDNA特异序列区域,设计了特异检测CPa的实时荧光PCR引物CPa1-F/CPa1-R及探针CPa-P。2、独创了单叶嫁接法,并与传统的芽条嫁接法进行比较。试验结果表明单叶嫁接传染CLas的传病率为79.00%（79/100）,而芽条嫁接的传病率49.17%（59/120）,单叶嫁接不仅传病效率高,传病速度也快。此外,长春花植株中可用于嫁接的单叶片数量远高于可用于嫁接的芽条数量,进一步表明单叶嫁接法比芽条嫁接法更有优势。3、三种不同嫁接组合试验的结果表明:CPa单独侵染长春花时引起花变叶、节间缩短和叶片丛生等症状,但并不导致植株死亡;CLas单独侵染长春花时会产生叶片斑驳的症状,约2个月后造成长春花死亡;CLas和CPa同时侵染长春花时,同时出现斑驳和花变叶等症状,且CLas的浓度显着低于CLas单独侵染时CLas的浓度,约3个月后长春花死亡,说明了CPa的侵染对CLas的生长具有一定的抑制作用。此外,试验结果还表明CLas在长春花植株内的转移速率较CPa快,但增殖速率较CPa慢。4、在染病长春花组织切片中,透射电镜观察到大量的CLas和CPa病原,两种病原菌都呈圆形、短椭圆形和杆状形等多种形态,无细胞壁的CPa病原以圆形居多。CLas的大小约为90420×3201700 nm,具有三层膜结构,膜厚度约为20 nm。而CPa大小约为57307×300700 nm,同样具有三层膜结构,膜厚度约为9 nm,在大小和膜厚度上小于CLas。在复合侵染的样品切片中可看到两者同时存在同一筛管细胞内,但因CPa限制了CLas的增殖,CLas病原菌数量较少。5、EMA-PCR技术的检测结果显示,50μg/mL的EMA试剂对长春花叶片中CLas的死菌抑制效果最明显;感染前期的长春花叶片中CLas活菌含量显着高于其他时期（p<0.01）,且症状最不明显;柑橘的中后期叶片中症状较明显,但CLas的活菌含量要高于前期叶片的CLas活菌含量。
郑正[7]（2017）在《柑橘黄龙病菌的全基因组测序及分析》文中研究表明柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing）是目前柑橘生产上最为严重的病害之一,对世界柑橘产业造成巨大的经济损失。该病害目前认为是由局限于韧皮部筛管细胞内一种革兰氏阴性细菌所引起,该细菌归属于原核生物、薄壁菌门、α-变型菌纲（Proteobacteriacea）的候选韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter spp.）,在柑橘上共发现三个种:亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus）、非洲种（Candidatus Liberibacter africanus）和美洲种（Candidatus Liberibacter americaus）,其中亚洲种“Candidatus Liberibacter asiaticus”是目前分布最广的（本研究中所提及的柑橘黄龙病菌均指“Candidatus Liberibacter asiaticus”）。由于柑橘黄龙病菌暂时还无法进行人工培养,导致很难从形态学、生物学、病原学等方面来进行病原的深入研究。随着DNA测序技术的不断发展,基因组学的研究成了微生物研究领域常用的重要手段,尤其为研究难培养微生物的基因功能提供了可能。本研究探索了使用富集-放大-高通量测序相结合的方法,成功地对柑橘黄龙病菌广东菌株A4、美国加州菌株HHCA和佛罗里达菌株FL17进行了基因组测序,通过比较全基因组重点分析原噬菌体区域的序列变异,利用不同噬菌体类型对中国南方不同地区的柑橘黄龙病菌种群多样性以及遗传结构进行分析研究;同时通过分析基因组鉴定了柑橘黄龙病菌基因组上的CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/cas（CRISPR associated protein genes）系统,探究不同类型柑橘黄龙病菌株与噬菌体的关系;另外,还鉴定分析了柑橘黄龙病菌基因组上的五个拷贝基因位点,并根据该位点设计引物,提高了检测柑橘黄龙病菌的敏感性。本研究取得的主要研究结果如下:1.首次探索了富集-放大-高通量测序相结合的方法,成功地提高柑橘黄龙病菌DNA在植物总DNA中的比例,并获得了较高质量的柑橘黄龙病菌DNA。通过Illumina Miseq测序,柑橘黄龙病菌广东A4菌株样品共得到3.28×107条reads;通过与参考基因组（Psy62,SC1和SC2）进行比对,共提取到636,810条reads,利用Velvet 1.2.10和CLC Genomic Workbench 7.5软件进行拼接,成功获得柑橘黄龙病菌广东A4菌株的全基因组序列。A4菌株的基因组全长为1,233,514 bp,GC含量为36.4%。序列分析发现A4菌株基因组只含有Type 2类型（SC2类似）的原噬菌体（命名为CGdP2）而不含有Type 1类型（SC1类似）的原噬菌体。注释结果显示CGdP2原噬菌体区域共编码43个基因,其中有24个基因与SC2噬菌体、FP2噬菌体以及gxpsy菌株序列的相似性大于>99%。与Psy62菌株基因组序列比较,在A4菌株的染色体区域上主要鉴定到3个较大的插入片段（1,890 bp,2,542 bp和2,107 bp）,其中携带有两个假定蛋白基因的1,890bp片段为A4菌株所特有。2.利用富集-放大-高通量测序相结合的方法,对采自美国加州（HHCA样品）和佛罗里达州（FL17样品）的柑橘黄龙病样品进行全基因组测序,其中加州HHCA样品是首次在美国加州报道的柑橘黄龙病样品。序列分析结果表明:加州HHCA菌株只含有Type 2类型的原噬菌体,而佛罗里达FL17菌株则只含有Type 1类型的原噬菌体;不同柑橘黄龙病菌株基因组间的染色体区域较为保守,其中较大的变异主要是在原噬菌体区域;不同地区来源的柑橘黄龙病菌株可含有不同类型的原噬菌体。此外,通过对目前在加州发现的两个菌株（HHCA菌株与SGCA5菌株）的原噬菌体区域序列进行比较分析,发现这两个菌株具有不同的原噬菌体类型。3.通过比较Type 1和Type 2两种类型原噬菌体序列,并根据这些特异序列分别设计了两种类型原噬菌体的特异引物,对采自中国南方地区的566个柑橘黄龙病菌样品中的原噬菌体类型进行鉴定,结果发现我国南方约90%的柑橘黄龙病菌样品只携带有单一类型的原噬菌体（Type 1或者Type 2）,6.36%的样品同时携带有两种类型的原噬菌体,而3.18%的样品不携带上述任何两种原噬菌体。种群遗传结构分析表明基于原噬菌体的类型可将我国南方柑橘黄龙病菌种群分为三组:I组包括了广东、福建、湖南、江西和浙江的柑橘黄龙病菌种群（遗传距离<0.03）;II组包括了广西和贵州的柑橘黄龙病菌种群（遗传距离<0.0114）;III组包括了云南和海南的柑橘黄龙病菌种群（遗传距离<0.1366）。此外,本研究还鉴定了Type 2类型噬菌体上两个变异较大的位点（Type2-6和Type2-8）。4.在柑橘黄龙病菌广东A4菌株基因组上首次鉴定了1个CRISPR位点并且在该CRISPR位点临近区域鉴定了一个具有相对保守结构域的Cas4蛋白以及多个具有DNA/RNA进程相关酶功能的Cas蛋白,表明A4基因组上具有结构和功能完整的CRISPR/cas系统。通过CRISPR重复位点的序列比较发现,含有不同类型原噬菌体的菌株具有不同的spacer序列,结合中国南方地区原噬菌体类型的分布规律,提出两种类型的噬菌体在同一个柑橘黄龙病菌细胞内可能存在竞争关系,且已侵染柑橘黄龙病菌细胞的噬菌体可能利用该CRISPR/cas系统抵御另一种噬菌体的入侵。5.对柑橘黄龙病菌广东A4菌株全基因组比对分析,共发现10个多拷贝位点位点,其中有五个位点含有390-bp的共同序列,注释结果表明这五个位点含有一个共同基因,即核糖核苷酸还原酶β亚基基因（nrdB）。五个nrdB基因中有三个nrdB基因较长（nrdBL,1,059 bp）,另外两个nrdB基因较短（nrdBS,378 bp）。蛋白功能预测分析表明nrdBL具有核糖核苷酸还原酶的关键活性位点;而nrdBS蛋白不具有任何的活性位点,但是nrdBS序列与nrdBL的3’端有99%的相似性。比对显示五个拷贝共有的序列在不同的柑橘黄龙病菌株间保守。与16S rRNA基因的进化比较分析发现,nrdB基因在对柑橘黄龙病菌株的系统分类鉴定上和16S rRNA基因具有一样稳定的进化关系。基于保守区域在nrdB基因上设计实时荧光引物,通过对262个采集自中国和美国的柑橘黄龙病样品进行检测,并与常用的检测引物进行比较发现,基于nrd B基因设计的Real-time PCR引物RNRf/RNRr的检测灵敏性是常用的16S rRNA基因检测引物HLBas/HLBr的三倍,而且RNRf/RNRr的稳定性是基于噬菌体高拷贝位点设计的引物LJ900f/LJ900r的两倍。
卢乃会,李强有,张曼其,何红,黄勤知,赵丽宏[8]（2016）在《柑橘黄龙病分子生物学检测方法研究进展》文中指出柑橘黄龙病是世界范围内极具破坏性的危险性病害,可防可控但不可治,加强黄龙病早期诊断,探索快速、准确、高灵敏度、高特异性的检测技术对防止该病害的传播蔓延具有极其重要的意义。综述了国内外关于柑橘黄龙病分子生物学检测诊断方面的研究进展,介绍了该领域各检测方法的特点和存在问题,主要介绍了PCR检测技术,提出了大批量黄龙病样品检测适宜选用巢式PCR检测方法。
王华堂,曾鑫年,薛培培,杨柳[9]（2014）在《Direct-PCR检测柑橘黄龙病的快速制样方法研究》文中研究说明【目的】开发一种适用于Direct-PCR快速简便、有效的柑橘黄龙病病原DNA提取方法。【方法】从样品制备、提取速度以及DNA纯度等方面,分别比较研究了2种Direct-PCR制样方法与普通试剂盒制样方法提取柑橘黄龙病病原DNA的优缺点,并利用优化的制样技术分别比较了柑橘黄龙病病原16S rDNA的扩增效果。【结果】其中一种Direct-PCR制样方法所提取的柑橘叶片样品经RT-qPCR检测可以检测出黄龙病病原;通过优化制样后,该方法所提取的样品还可以通过常规PCR进行黄龙病病原检测。【结论】开发了一种更为快速简便、有效的柑橘黄龙病病原DNA提取方法,可为大批量快速检测柑橘黄龙病提供技术支撑。
黄勤知[10]（2014）在《红江橙黄龙病Nested-PCR检测及其内生可培养细菌研究》文中研究说明本文对红江橙黄龙病的快速检测方法、红江橙苗木繁育基地与果园黄龙病带菌率及红江橙内生可培养细菌种群数量与种类差异等进行了研究。获得如下主要结果：1.红江橙黄龙病检测方法的筛选：选取已报道的柑橘黄龙病特异性引物，分别用rTaq DNA聚合酶和MightyAmp DNA聚合酶常规PCR以及Nested-PCR对红江橙黄龙病进行了检测，结果发现，在rTaq DNA聚合酶反应体系下常规PCR的检测结果的重复性、特异性、准确性等均不稳定；而在MightyAmp DNA聚合酶反应体系下，以CQULA03F/CQULA03R为引物的常规PCR以及Nested-PCR扩增的目的片段，其条带亮度较高、重复性较好、特异性也较强，表明该2种方法均可作为红江橙黄龙病的快速检测方法；其中Nested-PCR方法对反应体系中组分及酶的要求不高，稳定性好，且检测成本低，适宜大批次样本检测，为此，本文田间调查选用了Nested-PCR方法检测。2.用Nested-PCR法，对已显黄龙病症状的红江橙植株叶片、根、茎、果皮、果实等组织部位检测结果显示，各部位均可检测到特异条带，说明上述组织中均可携带黄龙病菌；进一步对表现为斑驳状、均匀黄花状、窄且无光泽状及花叶状叶片检测发现，其中以斑驳状叶片的阳性检测率达100%。因此，本文认为，表现有斑驳状叶片的植株可作为红江橙黄龙病田间诊断依据。3.本文对3个主要红江橙苗木繁育基地的嫁接苗、采穗母树（圃）和砧木苗共92份样品检测结果显示，3个苗圃的嫁接苗、采穗母树（圃）中均检测出黄龙病菌特异条带，其中嫁接苗带菌率23.9%（10.0%-36.4%），采穗母树（圃）带菌率21.2%（14.3%-25.0%），并从1个苗圃的砧木苗中检测出黄龙病菌特异条带。由此可见，红江橙苗木带菌率较高，可能是田间病原的主要来源之一。4.对廉江青平镇和红江农场共15个种植园461份样品检测结果表明，青平镇果园黄龙病带菌率为11.11%-28.89%，红江农场果园黄龙病带菌率为25.93%-30.76%；检测还发现，果园种植年限与黄龙病带菌率呈正相关，果园年限越长其果树带菌率越高，7年以上橙园黄龙病带菌率均达20%以上。5.用组织分离法，对经Nested-PCR检测后带菌与不带菌红江橙样本根茎叶部位进行内生可培养细菌分离，结果表明不带菌材料根茎叶部位内生菌数量均高于带黄龙病菌材料各部位的内生细菌数量，各部位菌量依次为健根>病根>健叶>病叶>健茎>病茎；依据细菌16SrDNA序列比对分析，不带菌材料17株内生细菌分属于10个不同的属，带菌材料15株内生可培养细菌也不属于10个属，二者内生细菌类群差异较明显；对各部位菌属和菌量统计结果分析，还发现带菌与不带菌材料各部位优势菌属数量和种类都发生了明显变化。由此可见，黄龙病菌入侵后，对红江橙各部位内生可培养细菌数量和种类均产生了较大影响。
二、应用PCR及Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用PCR及Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原研究（论文提纲范文）
（1）广西柳州市柑橘黄龙病综合防控存在的问题及对策研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 前言 |
| 1.1 选题的背景 |
| 1.2 本研究的意义 |
| 1.3 研究内容与采取的方法 |
| 1.4 国内外文献综述 |
| 1.4.1 柑橘黄龙病的命名由来 |
| 1.4.2 柑橘黄龙病在全球的分布及在中国的发生情况 |
| 1.4.3 广西柑橘黄龙病的发生情况 |
| 1.4.4 柑橘黄龙病的症状表现 |
| 1.4.5 柑橘黄龙病的寄主范围及传播途径 |
| 1.4.6 柑橘黄龙病病原的研究进展及分类 |
| 1.4.7 柑橘黄龙病的致病机理 |
| 1.4.8 柑橘黄龙病的诊断与检测方法 |
| 1.4.9 柑橘黄龙病的主要防治方法 |
| 2 柳州市柑橘黄龙病发生概况 |
| 2.1 近年来柑橘种植情况 |
| 2.2 柑橘黄龙病发生情况 |
| 2.3 柳州市柑橘黄龙病逐步蔓延的原因分析 |
| 2.3.1 种植面积不断扩大 |
| 2.3.2 气候不断变暖 |
| 2.3.3 检疫监管措施不到位 |
| 2.3.4 忽视柑橘木虱的防治工作 |
| 2.3.5 果农文化素质不高、防控意识淡薄 |
| 2.3.6 田间诊断难度大 |
| 3 柳州市柑橘黄龙病综合防控现状 |
| 3.1 柳州市柑橘黄龙病综合防控情况 |
| 3.1.1 2015年柳州市柑橘黄龙病综合防控示范区建设情况 |
| 3.1.2 2016年柳州市柑橘黄龙病综合防控示范区建设情况 |
| 3.1.3 2016年柳州市开展柑橘黄龙病综合防控情况 |
| 3.1.4 2017～2018年柳州市柑橘黄龙病综合防控示范区建设情况 |
| 3.2 总结柳州市开展柑橘黄龙病综合防控的主要做法 |
| 3.2.1 强化政府主导工作机制 |
| 3.2.2 加强普查,科学指导防控工作的开展 |
| 3.2.3 加强宣传培训,开展“送柑橘黄龙病防控技术入户”活动 |
| 3.2.4 推动柑橘无病毒苗木繁育体系建设 |
| 3.2.5 做好柑橘木虱的防治工作 |
| 3.2.6 建立示范样板,以点带面推动防控工作的开展 |
| 3.3 近年来柳州市在柑橘黄龙病综合防控上的亮点 |
| 3.3.1 政府主导的工作机制显着 |
| 3.3.2 运用植保航空喷药技术开展柑橘木虱的统防统治 |
| 4 柳州市柑橘黄龙病综合防控存在的问题 |
| 4.1 政策法规的执行力度不足 |
| 4.2 缺乏高效的组织管理职能 |
| 4.3 财政投入仍不足且资金到位慢 |
| 4.4 全面开展普查难度大 |
| 4.5 无病毒苗木繁育体系建设起步晚 |
| 4.6 柑橘苗木市场监管仍不到位 |
| 4.7 不能及时高效地清除病树 |
| 4.8 缺乏高素质的专业化种植管理队伍 |
| 4.9 田间诊断缺乏快速检测设备和技术 |
| 5 探究应对柳州市柑橘黄龙病综合防控存在问题的对策 |
| 5.1 建立健全政策法规制度 |
| 5.1.1 出台强制性政策法规 |
| 5.1.2 制定柑橘产业发展扶持政策 |
| 5.1.3 制定和发布统一的黄龙病诊断标准 |
| 5.2 加大财政资金投入力度 |
| 5.3 加快推进柳州市柑橘无病毒苗木繁育体系建设 |
| 5.4 进一步加强柑橘苗木检疫管理 |
| 5.4.1 从严管控调入苗木 |
| 5.4.2 加强宣传,严厉查处违规调运 |
| 5.5 加大清除病株执行力度 |
| 5.5.1 加大宣传力度 |
| 5.5.2 严格执行病树清除技术规程 |
| 5.5.3 发挥村民自治组织力量 |
| 5.6 加强做好柑橘木虱的防治工作 |
| 5.7 组建技术调查与监管队伍 |
| 5.8 加大柑橘黄龙病综合防控示范区的建设 |
| 5.9 建立柑橘黄龙病防控长效机制 |
| 6 结论和讨论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）柑橘黄龙病快速检测技术研制及应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写及符号说明 |
| 1 前言 |
| 1.1 柑橘黄龙病的发生与危害 |
| 1.1.1 柑橘黄龙病的发生 |
| 1.1.2 柑橘黄龙病的症状与危害 |
| 1.1.3 柑橘黄龙病的传播途径 |
| 1.2 柑橘黄龙病的病原与病原寄主 |
| 1.2.1 柑橘黄龙病病原 |
| 1.2.2 柑橘黄龙病病原菌培养 |
| 1.2.3 柑橘黄龙病病原寄主 |
| 1.3 柑橘黄龙病的诊断 |
| 1.3.1 田间诊断 |
| 1.3.2 血清学方法诊断 |
| 1.3.3 指示作物鉴定法 |
| 1.3.4 病原显微镜观察法 |
| 1.3.5 分子生物学诊断 |
| 1.3.6 光谱诊断 |
| 1.4 柑橘黄龙病的防控 |
| 1.5 研究目的意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与质粒 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要溶液配制 |
| 2.4 主要仪器设备 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 柑橘黄龙病菌外膜蛋白omp多克隆抗体的研制 |
| 2.5.2 柑橘黄龙病可视化环介导等温扩增(LAMP)检测体系建立 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 柑橘黄龙病菌外膜蛋白omp多克隆抗体的研制 |
| 3.1.1 总核酸的提取与黄龙病菌的PCR检测 |
| 3.1.2 引物设计 |
| 3.1.3 omp1目的片段克隆 |
| 3.1.4 原核表达载体构建 |
| 3.1.5 重组蛋白诱导表达 |
| 3.1.6 重组蛋白表达形式鉴定 |
| 3.1.7 重组蛋白Western Blot验证 |
| 3.1.8 重组蛋白纯化 |
| 3.1.9 多克隆抗体效价检测 |
| 3.1.10 多克隆抗体检测田间样品效果测试 |
| 3.2 柑橘黄龙病可视化环介导等温扩增(LAMP)检测体系建立 |
| 3.2.1 柑橘黄龙病LAMP引物设计与合成 |
| 3.2.2 柑橘黄龙病LAMP预实验 |
| 3.2.3 柑橘黄龙病LAMP体系Mg~(2+)浓度优化 |
| 3.2.4 柑橘黄龙病LAMP体系dNTP浓度优化 |
| 3.2.5 柑橘黄龙病LAMP体系内外引物浓度比例优化 |
| 3.2.6 柑橘黄龙病LAMP体系Bst DNA聚合酶大片段浓度优化 |
| 3.2.7 柑橘黄龙病LAMP反应温度优化 |
| 3.2.8 柑橘黄龙病LAMP反应时间优化 |
| 3.2.9 柑橘黄龙病LAMP检测结果可视化方法的比较 |
| 3.2.10 柑橘黄龙病LAMP特异性检测 |
| 3.2.11 柑橘黄龙病LAMP灵敏度检测 |
| 3.2.12 柑橘苗木与田间植株黄龙病的检测 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 柑橘黄龙病病原菌外膜蛋白omp多克隆抗体的研制 |
| 4.1.2 柑橘黄龙病可视化环介导等温扩增(LAMP)体系建立 |
| 4.2 结论 |
| 4.3 创新性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间参与科研及发表论文情况 |
（3）基于高光谱成像技术的柑橘黄龙病诊断方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号说明 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究的背景及意义 |
| 1.1.1 研究的背景 |
| 1.1.2 研究的意义 |
| 1.2 国内外研究进展分析 |
| 1.2.1 国外研究进展分析 |
| 1.2.2 国内研究进展分析 |
| 1.2.3 国内外研究进展总结 |
| 1.3 研究内容和技术方案 |
| 1.3.1 研究目的 |
| 1.3.2 研究内容 |
| 1.3.3 技术方案 |
| 1.4 本章小结 |
| 第二章 染病叶片的主要理化指标与高光谱关系研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 染病叶片PCR检测方法 |
| 2.2.1 PCR检测原理 |
| 2.2.2 PCR检测过程 |
| 2.3 染病叶片的主要理化指标相关性分析 |
| 2.3.1 实验样品准备 |
| 2.3.2 叶片主要理化指标测量 |
| 2.3.3 叶片主要理化指标含量与黄龙病的相关关系分析 |
| 2.4 主要理化指标方差分析与多重显着性差异分析 |
| 2.4.1 方差分析 |
| 2.4.2 多重显着性差异分析 |
| 2.4.3 主要理化指标分布规律 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于光谱信息的染病叶片定性判别模型研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验样品及高光谱图像采集 |
| 3.2.1 实验样品PCR检测 |
| 3.2.2 样品高光谱图像采集 |
| 3.3 叶片高光谱图像的ROI平均光谱提取与分析 |
| 3.3.1 叶片高光谱图像ROI平均光谱提取 |
| 3.3.2 叶片ROI平均光谱校正分析 |
| 3.4 染病叶片的光谱变量降维及特征筛选 |
| 3.4.1 染病叶片光谱变量降维 |
| 3.4.2 染病叶片光谱特征筛选 |
| 3.5 基于光谱特征的染病叶片判别模型建立和预测 |
| 3.5.1 基于光谱特征的染病叶片识别模型建立 |
| 3.5.2 基于光谱特征的染病叶片识别模型预测 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 染病叶片的主要理化指标光谱定量模型研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验叶片PCR检测分析与ROI平均光谱预处理 |
| 4.2.1 实验叶片PCR检测分析 |
| 4.2.2 叶片ROI平均光谱预处理 |
| 4.3 染病叶片主要理化指标光谱定量建模方法及统计分析 |
| 4.3.1 叶片理化指标光谱定量建模方法 |
| 4.3.2 不同病害程度的染病叶片叶绿素光谱定量模型研究 |
| 4.3.3 染病叶片主要理化指标信息统计分析 |
| 4.4 基于光谱的染病叶片主要理化指标定量模型构建及预测 |
| 4.4.1 基于光谱的染病叶片主要理化指标PLS模型研究 |
| 4.4.2 基于光谱的染病叶片主要理化指标ELM模型研究 |
| 4.4.3 理化指标的光谱定量模型RMSEP对比分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 基于图像信息的染病叶片可视化判别模型研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验样品制备与光谱分析 |
| 5.2.1 实验样品制备 |
| 5.2.2 样品光谱分析 |
| 5.3 基于SPA和 PCA的敏感波长选取及对应图像特征分析 |
| 5.3.1 基于SPA敏感波长选取及图像特性分析 |
| 5.3.2 基于PCA的波长灰度图像选择与特征研究 |
| 5.4 基于叶片特征图像的纹理特征提取和参数统计分析 |
| 5.4.1 基于联合概率统计的柑橘叶片图像纹理特征提取 |
| 5.4.2 基于GLCM的纹理特征参数统计分析 |
| 5.5 基于GLCM纹理特征的染病叶片判别模型及可视化诊断 |
| 5.5.1 基于GLCM纹理特征的染病叶片判别模型研究 |
| 5.5.2 不同纹理特征数的染病叶片诊断模型分析 |
| 5.5.3 基于MB-GLCM的染病叶片可视化诊断研究 |
| 5.6 本章小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 主要理化指标模型RMSEP的 LSD分析 |
| 附录B 叶片原始图像和前4个主成分灰度图 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及专利 |
| 致谢 |
（4）柑橘黄龙病田间诊断与检测技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 柑橘黄龙病田间诊断 |
| 1.1 田间症状诊断法 |
| 1.2 指示作物鉴定法 |
| 2 柑橘黄龙病室内检测 |
| 2.1 电镜检测法 |
| 2.2 血清学检测法 |
| 2.3 高光谱检测法 |
| 2.4 淀粉显色检测法 |
| 2.5 PCR检测 |
| 2.5.1 常规PCR |
| 2.5.2 巢式PCR |
| 2.5.3 LAMP PCR |
| 2.5.4 定量PCR |
| 2.5.5 数字PCR |
| 3 小结与展望 |
（5）柑橘黄龙病PCR检测和近红外技术快速检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 柑橘黄龙病的分布与危害 |
| 1.1.1 黄龙病的分布 |
| 1.1.2 黄龙病的危害 |
| 1.2 病原研究 |
| 1.3 寄主范围 |
| 1.4 传播途径 |
| 1.5 病害检测 |
| 1.6 柑橘黄龙病防控 |
| 1.7 研究目的、研究内容和研究意义 |
| 第2章 单头柑橘木虱体内黄龙病菌DNA提取方法的比较 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 主要试剂(盒)、引物和仪器 |
| 2.1.3 常用储备液配制 |
| 2.1.4 DNA提取方法 |
| 2.1.5 核酸样品浓度和纯度检测 |
| 2.1.6 核酸样品细菌通用引物PCR检测 |
| 2.1.7 柑橘黄龙病PCR检测 |
| 2.1.8 柑橘黄龙病qPCR检测 |
| 2.1.9 裂解法的应用 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 核酸浓度与纯度检测结果 |
| 2.2.2 核酸样品常规PCR检测结果 |
| 2.2.3 柑橘黄龙病qPCR检测结果 |
| 2.2.4 不同提取方法成本、步骤、耗时等方面比较 |
| 2.2.5 裂解法的应用 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 柑橘树体黄龙病菌LAMP检测制样方法的比较 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试材料 |
| 3.1.2 主要试剂(盒)、引物和仪器 |
| 3.1.3 常用储备液配制 |
| 3.1.4 DNA提取方法 |
| 3.1.5 核酸质量检测 |
| 3.1.6 LAMP扩增体系 |
| 3.1.7 应用常规PCR验证LAMP扩增结果 |
| 3.1.8 裂解法的应用 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 核酸浓度与纯度检测 |
| 3.2.2 LAMP和常规PCR病原核酸扩增结果 |
| 3.2.3 不同制样方法成本、步骤、耗时及环保比较 |
| 3.2.4 裂解法的应用 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 柑橘黄龙病近红外快速检测体系的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试材料与培养 |
| 4.1.2 主要试剂(盒)、引物和仪器 |
| 4.1.3 常用储备液配制 |
| 4.1.4 接种HLB植株检测 |
| 4.1.5 实验室样品光谱采集 |
| 4.1.6 判别模型的建立与优化 |
| 4.1.7 柑橘HLB近红外检测技术的应用 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 实验室样品近红外光谱结果分析 |
| 4.2.2 田间试验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 主要结论、创新之处和研究展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 创新之处 |
| 5.3 研究展望 |
| 附录：在读期间发表论文及参加科研项目情况 |
| 参考文献 |
| 后记 |
（6）韧皮部杆菌与植原体在长春花上互作关系的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词及汉英对照表 |
| 1 前言 |
| 1.1 柑橘黄龙病的研究概况 |
| 1.2 柑橘黄龙病病原的研究进展 |
| 1.3 植物病原植原体的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病原材料 |
| 2.1.2 植物材料 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液和培养基的配制 |
| 2.1.5 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 “Ca.P.asteri”特异Real-time PCR引物的设计与筛选 |
| 2.2.2 不同嫁接材料在长春花上的传病效率比较 |
| 2.2.3 三种不同嫁接组合试验 |
| 2.2.4 透射电镜观察 |
| 2.2.5 EMA-PCR法对植物叶片中活菌浓度的测定 |
| 2.2.6 植物总DNA的提取 |
| 2.2.7 DNA浓度的测定 |
| 2.2.8 “Ca.P.asteri”16S rDNA基因序列的Nested-PCR扩增 |
| 2.2.9 琼脂糖凝胶制作方法 |
| 2.2.10 PCR产物的纯化、回收 |
| 2.2.11 目的DNA片段与克隆载体的连接 |
| 2.2.12 连接产物转化大肠杆菌 |
| 2.2.13 重组质粒DNA的抽提 |
| 2.2.14 绝对定量实时荧光PCR |
| 2.2.15 “Ca.L.asiaticus”和“Ca.P.asteri”的Real-time PCR检测 |
| 2.2.16 数据统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 “Ca.P.asteri”实时荧光PCR检测体系的构建 |
| 3.2 长春花单叶嫁接与芽条嫁接传病率的比较 |
| 3.3 感染“Ca.L.asiaticus”和“Ca.P.asteri”后长春花的症状表现 |
| 3.4 “Ca.L.asiaticus”和“Ca.P.asteri”在长春花上的互作关系 |
| 3.4.1 感染“Ca.L.asiaticus”的长春花嫁接含“Ca.P.asteri”的叶片 |
| 3.4.2 感染“Ca.P.asteri”的长春花嫁接含“Ca.L.asiaticus”的叶片 |
| 3.4.3 健康长春花同时嫁接含有“Ca.L.asiaticus”和含有“Ca.P.asteri”的叶片 |
| 3.5 染病长春花体内“Ca.L.asiaticus”和“Ca.P.asteri”的形态特征 |
| 3.6 含“Ca.L.asiaticus”的植物叶片的EMA-PCR检测结果 |
| 3.6.1 抑制长春花体内“Ca.L.asiaticus”死细胞DNA扩增的最适EMA浓度 |
| 3.6.2 染病后不同时期的长春花和柑橘叶片中活菌的浓度比较 |
| 4 讨论与结论 |
| 4.1 感染“Ca.L.asiaticus”的长春花单叶嫁接优于传统的芽条嫁接 |
| 4.2 “Ca.P.asteri”在一定程度上抑制了“Ca.L.asiaticus”的生长 |
| 4.3 感染“Ca.L.asiaticus”和“Ca.P.asteri”的长春花症状的差异 |
| 4.4 “Ca.L.asiaticus”与“Ca.P.asteri”的病原形态的区别 |
| 4.5 EMA的使用终浓度及抑制效果 |
| 4.6 结论 |
| 4.7 进一步研究工作 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（7）柑橘黄龙病菌的全基因组测序及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词及英汉对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 柑橘黄龙病的研究概况 |
| 1.1.2 柑橘黄龙病病原的研究进展 |
| 1.1.3 柑橘黄龙病病原基因组学研究进展 |
| 1.1.4 柑橘黄龙病病原相关噬菌体的研究进展 |
| 1.1.5 细菌CRISPR的研究进展 |
| 1.2 研究目的及意义 |
| 1.3 研究技术路线 |
| 第2章 柑橘黄龙病菌广东菌株A4的富集及其全基因组测序 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 病原材料的来源与保存 |
| 2.2.2 病原在长春花上的保存 |
| 2.2.3 试剂和仪器设备 |
| 2.2.4 植物总DNA的提取 |
| 2.2.5 细菌基因组DNA的富集 |
| 2.2.6 富集后DNA的纯化 |
| 2.2.7 富集后DNA的扩增 |
| 2.2.8 柑橘黄龙病菌的荧光定量PCR检测 |
| 2.2.9 富集效果的评估测定 |
| 2.2.10 全基因的测序与拼接 |
| 2.2.11 Gap补齐与PCR验证 |
| 2.2.12 PCR产物的回收与克隆测序 |
| 2.2.13 全基因组的注释与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 柑橘黄龙病菌在长春花中的富集效果评估 |
| 2.3.2 柑橘黄龙病菌广东菌株A4的DNA富集效果评估 |
| 2.3.3 柑橘黄龙病菌广东菌株A4全基因组的测序与拼接 |
| 2.3.4 柑橘黄龙病菌广东菌株A4全基因组的基本特征 |
| 2.3.5 柑橘黄龙病菌广东菌株A4全基因组的插入/缺失片段的分析 |
| 2.3.6 柑橘黄龙病菌广东菌株A4相关原噬菌体的分析 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 柑橘黄龙病菌美国菌株的全基因组测序分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 病原材料 |
| 3.2.2 试剂和仪器设备 |
| 3.2.3 植物总DNA的提取 |
| 3.2.4 细菌基因组DNA的富集、纯化与扩增 |
| 3.2.5 柑橘黄龙病菌的荧光定量PCR检测 |
| 3.2.6 富集效果的评估测定 |
| 3.2.7 全基因的测序、拼接与PCR验证 |
| 3.2.8 PCR产物的回收与克隆测序 |
| 3.2.9 全基因组的注释与比较分析 |
| 3.2.10 原噬菌体类型的鉴定与序列分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 柑橘黄龙病菌株HHCA和FL17的富集效果评估 |
| 3.3.2 加州菌株HHCA和佛罗里达菌株FL17全基因组的测序结果 |
| 3.3.3 加州菌株HHCA和佛罗里达菌株FL17全基因组的基本特征 |
| 3.3.4 全基因组的比较分析 |
| 3.3.5 加州菌株的比较分析 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 柑橘黄龙病菌相关原噬菌体类型的多样性分析与应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 柑橘黄龙病菌株材料 |
| 4.2.2 试剂和仪器设备 |
| 4.2.3 柑橘黄龙病样品基因组DNA的提取 |
| 4.2.4 柑橘黄龙病菌相关原噬菌体的比较分析 |
| 4.2.5 不同类型原噬菌体特异引物的设计 |
| 4.2.6 柑橘黄龙病菌的Real-time PCR检测 |
| 4.2.7 原噬菌体特异引物的常规PCR扩增 |
| 4.2.8 PCR产物的回收与克隆测序 |
| 4.2.9 数据统计与分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 两种类型原噬菌体差异序列的鉴定以及特异引物的设计 |
| 4.3.2 含有不同原噬菌体类型柑橘黄龙病菌株的PCR结果 |
| 4.3.3 基于原噬菌体类型对柑橘黄龙病菌种群的多样性分析 |
| 4.3.4 基于原噬菌体类型对中国南方柑橘黄龙病菌种群的遗传结构分析 |
| 4.3.5 原噬菌体变异位点的分析 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 柑橘黄龙病菌基因组中CRISPR/cas系统的鉴定与分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 病原材料 |
| 5.2.2 试剂和仪器设备 |
| 5.2.3 CRISPR重复序列的鉴定 |
| 5.2.4 CRISPR引物的设计 |
| 5.2.5 CRISPR位点的PCR扩增及产物的克隆测序 |
| 5.2.6 CRISPR重复序列在不同菌株中的比较分析 |
| 5.2.7 CRISPR相关cas基因的分析 |
| 5.2.8 CRISPR相关Spacer的分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 CRISPR重复序列的鉴定 |
| 5.3.2 不同菌株中CRISPR序列的比较分析 |
| 5.3.3 cas4基因的鉴定 |
| 5.3.4 柑橘黄龙病菌基因组中的CRISPR/cas系统的鉴定 |
| 5.3.5 CRISPR/cas系统与噬菌体的潜在关系分析 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 柑橘黄龙病菌基因组中多拷贝基因的鉴定分析与应用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 柑橘黄龙病菌菌株材料 |
| 6.2.2 试剂和仪器设备 |
| 6.2.3 植物DNA和柑橘木虱总DNA的提取 |
| 6.2.4 柑橘黄龙病菌基因组中多拷贝位点的鉴定 |
| 6.2.5 高拷贝基因的鉴定与描述 |
| 6.2.6 nrdB基因的序列变异分析 |
| 6.2.7 nrdB基因的系统发育和进化分析 |
| 6.2.8 Real-time PCR引物的设计 |
| 6.2.9 引物的特异性及灵敏性评估 |
| 6.2.10 数据统计与分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 多拷贝位点的鉴定 |
| 6.3.2 多拷贝位点基因的鉴定及序列分析 |
| 6.3.3 nrdB基因的蛋白结构分析 |
| 6.3.4 nrdB基因与 16S rRNA基因的进化分析 |
| 6.3.5 RNRf/RNRr引物的特异性评估 |
| 6.3.6 RNRf/RNRr引物与常用引物的敏感性比较 |
| 6.3.7 RNRf/RNRr引物在田间大量样品中检测敏感性评估 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 全文讨论与结论 |
| 7.1 全文讨论 |
| 7.1.1 富集效果的评估与测序数据分析 |
| 7.1.2 柑橘黄龙病菌广东菌株的全基因组测序分析 |
| 7.1.3 两个加州菌株的比较分析 |
| 7.1.4 我国南方地区柑橘黄龙病菌种群分布规律分析 |
| 7.1.5 Type 2类似原噬菌体变异位点分析 |
| 7.1.6 cas的鉴定分析以及CRISPR/cas系统的功能分析 |
| 7.1.7 五个拷贝nrdB基因的特异性与功能分析 |
| 7.2 总结论 |
| 7.3 本研究的主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（8）柑橘黄龙病分子生物学检测方法研究进展（论文提纲范文）
| 1 核酸探针检测 |
| 2 环介导恒温技术 |
| 3 PCR检测技术 |
| 4 结语 |
（9）Direct-PCR检测柑橘黄龙病的快速制样方法研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 植物材料 |
| 1.2 制样方法 |
| 1.3 常规PCR和Nested-PCR扩增 |
| 1.4 RT-q PCR检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 样品总DNA的质量浓度和纯度 |
| 2.2 常规PCR和Nested-PCR扩增产物电泳观察 |
| 2.3 RT-q PCR检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（10）红江橙黄龙病Nested-PCR检测及其内生可培养细菌研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 文献综述 |
| 1.1 柑橘黄龙病病原研究 |
| 1.2 病原寄主范围 |
| 1.3 柑橘黄龙病检测方法 |
| 1.3.1 显微检测 |
| 1.3.2 血清学检测 |
| 1.3.3 生理生化指标检测 |
| 1.3.4 高光谱成像检测 |
| 1.3.5 分子生物学检测 |
| 1.4 柑橘黄龙病的防控 |
| 1.4.1 规范管理 |
| 1.4.2 培育无病苗木 |
| 1.4.3 化学防治 |
| 1.4.4 生物防治 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 2 红江橙黄龙病检测方法筛选 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试材料 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 缓冲液配制 |
| 2.1.5 引物合成 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 红江橙样品基因组总 DNA 提取 |
| 2.2.2 红江橙的常规 PCR 检测方法 |
| 2.2.3 红江橙黄龙病的 Nested-PCR 检测方法 |
| 2.2.4 MightyAmp 聚合酶 PCR 反应和 Nested-PCR 检测方法比较 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 红江橙基因组 DNA 提取 |
| 2.3.2 利用 rTaq 酶进行 PCR 反应的引物筛选 |
| 2.3.3 利用 Mighty Amp 酶进行 PCR 反应的引物筛选 |
| 2.3.4 Mighty Amp 酶 PCR 反应条件优化 |
| 2.3.5 Nested-PCR 反应条件筛选 |
| 2.3.6 Mighty Amp 聚合酶 PCR 反应和 Nested-PCR 检测方法比较 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 红江橙苗圃及橙园黄龙病带菌率检测 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试材料采集及来源 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.1.3 数据处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 感病植株不同部位检测和目的片段序列分析 |
| 3.2.2 田间不同黄化症状类型材料检测 |
| 3.2.3 红江橙苗圃黄龙病带菌率 |
| 3.2.4 红江橙果园黄龙病带菌率 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 4 红江橙内生可培养细菌研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试材料 |
| 4.1.2 供试材料携带黄龙病菌检测 |
| 4.1.3 病、健材料内生细菌的分离、计数与归类 |
| 4.1.4 内生细菌的 16S rDNA 扩增与测序 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 样本携带黄龙病菌检测 |
| 4.2.2 携带病菌和不带病菌的红江橙各组织内生可培养细菌平板分离 |
| 4.2.3 带菌与不带菌红江橙内生细菌的类群鉴定和分析 |
| 4.2.4 带菌与不带菌红江橙各部位内生细菌类群与数量比较分析 |
| 4.2.5 带菌与不带菌材料根茎叶部位的优势细菌类群分析 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 5 结论与有待进一步研究的问题 |
| 5.1 主要研究结果 |
| 5.1.1 筛选优化红江橙黄龙病检测方法 |
| 5.1.2 苗圃和果园黄龙病带菌率 |
| 5.1.3 携带与不携带黄龙病的红江橙内生可培养细菌研究 |
| 5.2 有待进一步研究的问题 |
| 5.2.1 植株体内黄龙病菌动态研究 |
| 5.2.2 内生细菌的功能分析 |
| 5.2.3 对红江橙病、健组织内生不可培养细菌的研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 红江橙黄龙病田间症状特征 |
| 附录B 韧皮部杆菌属亚洲种特异性片段序列 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
四、应用PCR及Nested-PCR技术检测柑橘黄龙病病原研究（论文参考文献）
- [1]广西柳州市柑橘黄龙病综合防控存在的问题及对策研究[D]. 刘晓彬. 广西大学, 2019(01)
- [2]柑橘黄龙病快速检测技术研制及应用[D]. 李彬. 广西大学, 2019(01)
- [3]基于高光谱成像技术的柑橘黄龙病诊断方法研究[D]. 肖怀春. 华东交通大学, 2019(03)
- [4]柑橘黄龙病田间诊断与检测技术研究进展[J]. 唐利华,郭堂勋,李其利,黄穗萍,莫贱友. 中国植保导刊, 2018(08)
- [5]柑橘黄龙病PCR检测和近红外技术快速检测方法的建立与应用[D]. 丁鹏. 赣南师范大学, 2018(01)
- [6]韧皮部杆菌与植原体在长春花上互作关系的初步研究[D]. 陈俊甫. 华南农业大学, 2018(08)
- [7]柑橘黄龙病菌的全基因组测序及分析[D]. 郑正. 华南农业大学, 2017(08)
- [8]柑橘黄龙病分子生物学检测方法研究进展[J]. 卢乃会,李强有,张曼其,何红,黄勤知,赵丽宏. 现代农业科技, 2016(12)
- [9]Direct-PCR检测柑橘黄龙病的快速制样方法研究[J]. 王华堂,曾鑫年,薛培培,杨柳. 果树学报, 2014(04)
- [10]红江橙黄龙病Nested-PCR检测及其内生可培养细菌研究[D]. 黄勤知. 广东海洋大学, 2014(01)