一、Superantigen-SEA gene modified tumor vaccine for hepatocellular carcinoma:An in vitro study（论文文献综述）
吴尘轩[1]（2008）在《增强树突状细胞及其相关exosome抗肝癌免疫效应的实验研究》文中认为肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的临床治疗效果较差,研究者不断探索有效的治疗方法以期减少术后复发、延长生存时间、提高总体疗效。随着免疫学等基础研究的不断深入,生物治疗日益显示出良好的应用前景。作为肿瘤生物治疗策略之一的树突状细胞（dendritic cell,DC）疫苗的研究与应用已取得相当大的进展。然而在实际应用中DC疫苗的治疗效果往往不如预期,为此,众多学者尝试多种途经增强DC诱导的肿瘤特异性免疫反应,这其中包括对不同来源DC的比较和选择,联合其他辅助药物如中药、多种细胞因子,以及研制新型亚细胞瘤苗exosome等来调节或替代DC功能。Exosome是肿瘤细胞和DC均能分泌一种膜性微囊结构,其重要特性是携带来源细胞的各种功能蛋白,且理化性质稳定、耐高温、制备时易于质控,已经在黑色素瘤、肺癌等的治疗中取得良好效果,用于抗肝癌的研究尚处于探索阶段。本课题尝试应用多种来源的单核细胞作为前体制备DC疫苗,又分别制备人肝癌细胞株SMMC7721来源（Tumor-derived exosome,Texo）和DC来源的exosome（DC-derived exosome,Dexo）,研究其对抗肝癌免疫的诱导及调节效应,并初步探讨了中药单体黄芪甲苷对DC及其相关exosome诱导特异性抗肿瘤免疫的调节作用,为研制更具临床应用前景的用于肝癌的肿瘤疫苗和提高其治疗效果提供更多选择。目的1.应用多种来源的单核细胞,通过简便有效的方法,体外诱导培养获得足够数量及具成熟表型的DC,为DC疫苗的进一步研究及应用打下基础;2.对比分析Texo和Dexo的形态、表型及功能,研究此新型亚细胞瘤苗在抗肝癌免疫中的作用;3.观察中药单体黄芪甲苷（AstragalosideⅣ,ASI）对于DC及其exosome免疫功能的调节作用,探讨其作为免疫增强剂的可行性。方法1.提取健康人外周血、人脐血及肝癌患者术中失血的单核细胞,用细胞因子组合rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导培养DC,光镜、电镜观察形态,流式细胞仪鉴定其表型;2.离心/超滤/超离法提取SMMC 7721来源exosome（Texo）及SMMC 7721抗原致敏DC来源的exosome（Dexo）,电镜观察,Western-blot检测其携带的蛋白;观察二者刺激淋巴细胞增殖情况,ELISA检测淋巴细胞培养上清中IL-2,MTT法检测不同组合激活的效应淋巴细胞对SMMC-7721的细胞毒效应。3.在DC诱导培养过程中加入ASI,光镜及电镜观察细胞形态,流式细胞仪检测DC表型,ELISA法测定培养上清中IL-12和MHCⅡ类分子水平;观察黄芪甲苷对DC刺激淋巴细胞增殖的影响;MTT法测定黄芪甲苷作用下DC及Dexo诱导的CTL对SMMC 7721特异性杀伤效应。结果1.三种来源的单核细胞均可体外诱导培养为具有典型形态和表型的DC;术中失血来源DC表面标志物表达水平稍低,但较未诱导前有显着的提高。2.应用少量细胞培养上清（60～80mL）提取exosome;Dexo和Texo具有相似的形态特征;前者表达CD40、CD80、CD81、CD86、CD54、MHCⅠ、MHCⅡ（HLA-DR）;而后者CD40缺乏,CD80、CD86和MHCⅡ（HLA-DR）相对低表达;二者在DC参与下均可显着刺激淋巴细胞增殖及IL-2分泌,且能激发较强的针对SMMC7721的特异性细胞毒作用,效果高于致敏DC组（P＜0.05）;Dexo具有刺激淋巴细胞活化增殖的作用,并可诱导具有特异性杀伤活性的CTL,杀伤效率（%）明显高于单纯Texo（30.93±11.1 vs 10.24±7.37,P=0.004）,但低于致敏DC组（30.93±11.1%vs 43.76±8.93%;P=0.050）。3.黄芪甲苷作用下DC生长状态及形态特征较常规诱导组无明显差异;各表面标志较常规诱导组均有不同程度上调,其中CD83表达显着上调（73.5%vs 41.3%）;DC培养上清IL-12含量（pg/mL）较常规诱导组明显升高（632.65±14.26 vs 442.85±38.96,P=0.000）,且该组DC刺激淋巴细胞增殖作用增强;黄芪甲苷可使未成熟DC释放exosome增加,并可促进DC诱导的CTL对SMMC7721的特异性杀伤（%）（59.98±5.23 vs 46.50±2.31,P=0.002）,而对Dexo无明显作用。结论1.健康人外周血、脐血和肝癌病人术中失血来源单核细胞均可在体外诱导获得具有典型形态和表型的成熟DC,用于后续肝癌DC疫苗实验研究;肝癌术中失血来源DC成熟度稍低,但有望通过体外诱导培养并添加促成熟因子提高肝癌患者DC成熟标志物的表达,从而提高其免疫功能。2.Dexo作为一种既携带肿瘤抗原又具有抗原提呈作用的亚细胞结构,可诱导淋巴细胞的增殖,诱发特异性杀伤效应,此作用在DC参与下明显增强,Dexo有可能完全或部分替代DC而发挥肿瘤疫苗或天然抗肿瘤佐剂的作用;Texo在体外不能单独诱导初始T淋巴细胞活化增殖,但是在机体内环境中仍然有可能发挥其免疫学功能,诱导有效的抗肝癌免疫反应。3.黄芪甲苷可通过促进DC成熟和抗原提呈功能、增加其功能性细胞因子IL-12的释放,进而增强DC诱导的特异性CTL细胞毒作用,因此有望作为一种天然的免疫增强剂应用于DC介导的抗肝癌治疗。
苏纪权[2]（2007）在《RNAi干扰树突状细胞CD40基因对移植排斥反应影响的体外研究》文中研究指明目的:探讨RNAi （RNA interference）技术沉默树突状细胞CD40基因,建立DC（Dentritic cells）细胞培养及转染方法,对体外脾淋巴细胞的影响,对IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10分泌的影响,为寻求治疗急性移植排斥反应提供基础研究。方法:1.DC细胞培养:培养参照Giannoukakis等报道的方法[Molecular Therapy 2000;1（5）:430-437]。从Dark Agouti （DA）供体大鼠股骨中获取的骨髓细胞在含2ml RPMI-1640的24孔培养板（2×106/孔）中培养,其中含抗生素10%（v/v）小牛血清FCS。加入基因重组大鼠GM-CSF（20ng/mL）以扩增未成熟DC。除GM-CSF外,加入基因重组大鼠IL-4 （20 ng/mL）以获得成熟DC。在选定的培养孔,于培养开始时分别加入pSilencer1:U6-CD40 siRNA和pSilencer空白质粒转染细胞,以鉴定siRNA-CD40抑制由IL-4诱导的DC成熟的能力和其抑制DC中CD40基因表达的能力。每2天更换富含细胞因子的培养液;轻微旋动培养板后,吸除一半旧培养液,再加入等量且含细胞因子的新鲜培养液。因此,非贴壁的粒细胞将被清除又可确保那些已生长出的松散地附在弹性帖壁巨嗜细胞单层上的DC细胞簇不被同时移除。10天后收集那些自动从DC细胞簇离开的未帖壁DC。2.大鼠Silencer2.1-U6- siRNA-CD40重组质粒的构建与鉴定（1）siRNA靶位点的选择及编码siRNA DNA模板的体外合成根据GeneBank（AF241231）大鼠CD40基因mRNA的已知序列,寻找符合特征的靶序列,合成分别针对其三个编码区合成两条DNA寡核苷酸链（分别命名为CD40 -1,-2,-3）并用RNA structure 4.11软件对其二级结构预测,每条模板链的组成包括19个碱基正义链和与其互补的19个碱基的反义链,正反链之间有9个碱基（TTCAAGAGA）间隔,反义链之后有5个T作为转录终止信号,在模板链的两端加入Hind III及BamH I酶切位点。合成两条链在退火缓冲液（100mM K-acetate, 30mM HEPES-KOH pH 7.4, 2 mMMg-acetate）作用下退火（90℃,3min,37℃,1hr）,形成双链结构。待连接。（2）pSilencer2.1-U6载体线性化及回收pSilencer?2.1-U6 neo质粒:全长4521bp,含有U6启动子,氨苄抗性,含NEO基因,可由新霉素筛选稳定转染。pEGFP质粒:带有增强绿色荧光蛋白的原核克隆和表达载体,全长3.4kb,含有LacZ启动子,氨苄抗性;同时与Silencer2.1-U6-siRNA重组共转染,估计细胞体系的转染效率。将pSilencer2.1-U6用BamH I及Hind III分别消化,对消化后产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,将含有线性化质粒的凝胶在紫外灯下切下,放入1.5ml离心管中,加入3倍体积的融胶液,45℃-55℃水浴5-10min,使胶完全融化,加入10μl玻璃奶（通常1μgDNA用1μl玻璃奶）,混匀,45℃-55℃冰水浴5-10min,其间每隔2-3min混匀一次,5,000转/min离心30-60s,弃上清,加入400μl洗液,轻弹管底,5,000转/min离心30s,弃上清,重复上述步骤一次,吸净洗液,室温干燥,加入10-30μl无菌双蒸水,将玻璃奶悬起,45℃-55℃水浴5-10min,10,000转/min离心1-2min,回收上清用λDNA mark做标准品定量,待连接。（3）载体与siRNA模板链连接连接体系中模板与载体的摩尔数比约为3-5:1,充分混匀,加入T4连接酶16℃反应过夜。连接产物可立即转化感受态细胞或于-20℃保存。同时进行空载体自身环化作为阴性对照。（4）感受态细胞的制备与连接产物的转化取-70℃保存的GM109大肠杆菌接种于平板,次日挑取单菌落接种于LB固体培养基中,370C培养过夜。用无菌签挑取单菌落,转到3mlLB液体培养基中,37℃300rpm振荡2h,取1ml菌液接种到100ml LB培养基中,37℃继续培养待OD600大约为0.4时取出,冰浴10min。将菌液转到灭菌的预冷50ml离心管中,4℃4000g离心10min回收细菌,重悬于10mlCaCl2（0.1mol/L）中,冰浴30min , 4℃4000离心10min ,弃上清,加4 ml预冷的CaCl2（0.1mol/L）,置于4℃,16h后用于转化试验,或加入甘油至终浓度10%,-70℃保存备用。取100μl的感受态细菌,加入5μl pSilencer2.1-U6与siRNA连接产物,用空载体作对照,轻轻旋转混匀,冰浴30min,42℃热休克90s,快速放置冰浴中2min,加入800μl LB培养基（不含Amp）,37℃振荡培养60min,吸100μl培养液滴于含Amp的LB平板涂匀,待表面液体吸收后,倒置平皿37℃培养16-20h。（5）阳性重组克隆的筛选（碱裂解法）15,000rpm离心10min,弃上清,加入冰冷的75%乙醇洗一次,离心室温干燥,用含RNase（50μg/ml）的双蒸水10μl充分溶解沉淀。用M13F（-40）: 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’ Rev: 5’-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3’ primer测序。（6）重组质粒的转染DC细胞用RPMI1640培养基加10%小牛血清37℃,5% CO2培养。用100 ml培养瓶,当贴壁细胞达到80%-90%融合,用无血清培养基洗三遍,将脂质体15μl加无菌水85μl室温放置10分钟,重组质粒18μg用无菌水加至总体积100μl室温放置10分钟,两者混合室温放置10分钟后加入细胞无血清培养液中,用pEGFP质粒与psilencer1.0-U6-CD40-siRNA按1:20的比例以慢病毒为载体共转染,以标记阳性转染的细胞;空质粒对照用psilencer1.0-U6质粒,另外一组只用脂质体加入培养细胞内;于转染后24-72小时,加G418（新霉素）进行稳定转染阳性克隆筛选,筛选21天后收集细胞,做Western blot分析。3.Western blot测定RNAi干涉后CD40基因在DC中的表达情况裂解RNAi干涉后的DC,用常规Western blot方法检测CD40表达情况。4.单向混合淋巴细胞反应（MLR）采用3HTdR掺入法。刺激物为RNAi干涉后的DC;反应物为Lewis大鼠的脾细胞。最后用自动液闪计数仪测定每分钟脉冲数值。5.通过ELISA的方法检测大鼠淋巴细胞分泌细胞因子的情况。6.统计学分析所得数据以均数±标准差表示,用SPSS软件包（10.0版）进行统计学处理,多组资料均数比较采用F检验,若差异有显着性,则进一步进行q检验。结果:1.成功从大鼠骨髓细胞中体外诱导培养出树突状细胞。2.通过感染含有RNAi序列的慢病毒可以抑制树突状细胞中CD40的表达。3.RNAi沉默后树突状细胞体外活化脾细胞的能力减弱。4.RNAi干涉后的DC活化的淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的量显着减少结论:应用RNAi技术沉默DC上的CD40,切断第二信号传递使T细胞沉默,不被激活,达到抑制急性免疫排斥反应。
孙玉静[3]（2005）在《肿瘤基因工程纳米疫苗的研制及抗肿瘤效应的研究》文中指出恶性肿瘤严重危害人类健康。肿瘤免疫治疗已成为肿瘤防治领域的热点。肿瘤蛋白疫苗具有安全,有效的特点,可以对表达肿瘤抗原的肿瘤产生治疗作用。黑色素瘤相关抗原1（MAGE-1）是一种免疫治疗的理想靶分子,它在多种肿瘤组织中表达而不在除睾丸和胎盘以外的正常组织表达。热休克蛋白是一种免疫佐剂,可以增强肿瘤抗原的免疫反应。我们在以往的研究中已证实MAGE-1与HSP70的融合蛋白可以增强动物机体针对MAGE-1的免疫反应,是一种优良的肿瘤蛋白疫苗。但是肿瘤蛋白疫苗在走向临床运用的过程中还面临很多困难。其一,由于机体免疫环境很复杂,有效的抗肿瘤免疫不仅需要特异性CD8+T细胞的活化,还需要辅助性CD4+T细胞的参与;其二,疫苗的抗原递呈效率低,难以有效活化T淋巴细胞。其三,蛋白质分子进入体内易受环境影响（如酶解）而发生失活。这些因素导致某些肿瘤疫苗在体外实验中有效而在体内实验中无效;在动物实验中有效而在临床实验中效果不佳。因此,采用适当的手段加强肿瘤蛋白疫苗的效果对推动肿瘤疫苗发展具有重要意义。 本研究首先制备出具有优良性能的纳米药物载体-纳米乳剂,然
王全楚[4]（2004）在《HCV C-Fc融合基因疫苗修饰的树突状细胞功能研究》文中研究指明丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）引起的慢性传染性疾病。丙型肝炎是严重威胁人类健康的常见疾病，全球约有1.7亿感染者。由于目前还没有确实有效的治疗方法，也还没有研制出疫苗，因此感染者中绝大部分可发展成慢性感染、进而部分可发展成肝硬化和肝细胞癌，因此危害极大。目前亟需发展一种有效的预防和治疗方法。 由于HCV疫苗研究的重要性，自1989年HCV基因获得克隆以来，人们一直在致力于疫苗的研究，但进展缓慢。原因是多方面的，归纳起来主要有三点：（1）HCV复制力差，体内滴度低，不易传代培养，不能大量制备。（2）HCV感染力弱，目前没有理想的细胞模型，除黑猩猩外，目前无其它易感染动物模型。（3）HCV基因具有高变异特性，以及HCV编码的不少蛋白质具有致癌性，因此，抗原的选择受到一定的限制。 当然，在HCV基因组已完全搞清、基因工程技术发展的今天，疫苗免疫原的制备应已不成问题，病毒基因表达质粒或重组病毒蛋白质均已可以大量制备。细胞和动物模型曾是影响HCV疫苗研究的又一因素，虽然目前还不能完全令人满意，但已发现不少人类细胞株，如肝细胞、T、B细胞株，可和HCV呈高亲和力结合及为HCV染感，并能为中和性抗体所中和，因此可以评第四军医大学博士学位论文 价免疫机体中和性抗体的产生。丙型肝炎病毒（HCV）基因疫苗 诱导特异性免疫应答产生己被大量的实验室证实，但普遍存在 着抗体滴度不高，CTL杀伤率不强等问题。其原因可能与HCV 感染后，抗原提呈细胞（APC），尤其是树突状细胞（dendri tic cells，DC）数量减少、功能降低有关。如何绕过或提高DC免 疫功能低下，诱导出更强有力的、更具广泛性的免疫应答，应 当成为基因疫苗和免疫治疗鱼待解决的突出问题之一。 治疗性疫苗，是当今一个吸引人的、有着广阔应用前景的研究领域。树突状细胞作为体内重要的专职抗原提呈细胞（APC），是机体T细胞特异免疫应答的直接启动和调控者。近年来，树突状细胞的分化发育、抗原加工提呈机理及其在肿瘤、感染、自身免疫性疾病和移植排斥中的作用己经成为免疫学的前沿领域，从树突状细胞中寻找免疫新分子是目前免疫学领域的一大研究热点。对DC的研究不仅有助于深刻了解机体免疫应答的调控机制，而且可以了解DC对相关疾病发生的影响从而制定相应的防治措施。 25年前Steinman和Cohn在深入地研究了DC在造血器官 组织中的分布，识别，分化和功能特点。发现它们有激发抗原 特异免疫应答的能力，非常适合作为疫苗制剂。DC干细胞在体 外容易从血液和骨髓中分离和操作，使得临床应用具有可行性。 用DC作为肿瘤疫苗制剂的实验己经开始。用药途径和剂量的选 择，给药的时间，被提呈的抗原性质，理想的成熟期是以现有 的DC生物学和从体外研究和动物模型获得的治疗作用知识为基 础的。DC免疫治疗的继续进展和精密的治疗策略将不仅依赖于 实验室研究的结果，更以人体临床试验的结果为基础。业已证 实，DC是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，也是唯一能激 活初始T细胞的抗原呈递细胞。因此，应用抗原或抗原多肤体 外冲击致敏DC，然后将之回输或免疫接种荷瘤宿主或带病毒特 异性抗原的宿主，进行免疫治疗;利用DC与肿瘤细胞融合成为第四军医大学博士学位论文 新型带有DC功能及肿瘤特异抗原的融合细胞瘤苗的报道;以及 利用病毒载体将带有肿瘤或病毒抗原的编码基因转染DC，使之 在DC内持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗肿瘤或抗病毒免疫反应〔们等方法应运而生。这些方法存在着DC激活时间 短，治疗不彻底或利用病毒载体的安全性等问题。 病毒已经形成了许多用以逃脱宿主免疫反应的机制。这包括:减少抗原表位的表达，MHC表位的基因突变，CTL克隆的耗竭，下调 MHC一I类与MHC/肤复合物的表达，产生免疫细胞因子与受体，以及下调某些决定性的细胞因子。所以，一个理想的抗原提呈策略，应当是全方位、强有力的诱导CD扩CTL、CD扩Th及B细胞应答，这样才能更有效的清除病原体及肿瘤细胞。近年来，以免疫球蛋白（主要是工gGI）的Fc段为基础构建的新型免疫分子进展很快，有望用于新型免疫复合制剂的研制。工gGI的Fab与FC是功能相对独立的片段，Fab中的可变区负责与抗原结合，而Fc段能与免疫效应细胞的F。Y受体（Fc YR）结合，发挥其调节免疫效应、细胞炎症反应、细胞毒效以及激活吞噬细胞的作用。DC本身表面带有Fc丫R，因此由FC YR介导的吞噬细胞内在化的过程可加强免疫应答的抗原提呈。 本研究旨在构建出包含fJCVC一Fc融合基因的可分泌型真核 表达载体，转染经体外活化的DC，利用已建立的表达HCvC抗 原的靶细胞（SPZ/O一HCV一C）及HCV感染荷瘤鼠（BALB/c小鼠）模 型，观察HCVC一Fc融合基因疫苗修饰的DC，诱导的特异性CTL、 抗体强度，以及对T细胞的增殖作用。研究基因疫苗转染前后， DC对抗原提呈作用的变化，探索HCVC一Fc融合基因疫苗修饰的 DC，用于预防和治疗HCV感染的可能性和可行性。 研究内容及实验结果如下: 1本文选用人工gGIFc段基因作为目的基?
叶菁[5]（2003）在《热休克蛋白70与MAGE-1融合基因疫苗和蛋白疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究》文中指出随着现代的细胞和分子免疫学的发展，人们已经基本明确机体在肿瘤的免疫识别和免疫调节过程中的分子机制，在此基础上，研究特异性的肿瘤疫苗正逐渐成为肿瘤生物治疗的重要手段。但是由于缺乏特异抗原和有效的抗原递呈，以及MHC的限制和肿瘤异质性等原因，使现有肿瘤疫苗的使用范围和效果相当有限。Hsp70是一个高度保守的蛋白，其在蛋白的转运、折叠以及抗原的加工递呈过程中均具有重要作用。研究表明，Hsp70可作为一种分子载体，增强与其结合蛋白的抗原性。MAGE-1是一种广泛证实的肿瘤特异性抗原，其在多种肿瘤中均有表达，而在正常组织细胞（除睾丸外）均不表达。本研究构建以Hsp70为疫苗载体，MAGE-1为靶抗原的肿瘤DNA疫苗与蛋白疫苗，并研究疫苗对机体细胞及体液免疫的作用，以及对小鼠肿瘤模型的治疗作用。 1．采用RT-PCR从HepG2细胞总RNA中克隆MAGE-1的基因，经测序，与GeneBank公布的序列一致；对MAGE-1基因编码的蛋白的理化性质进行分析表明MAGE-1的前100个氨基酸残基的疏水性较高，并可能含有一个跨膜序列，其后100个氨基酸残基的抗原性较高；通过Blast软件对MAGE-1编码的蛋白进行特异性分析表明，MAGE-1蛋白的后100一个氨基酸残基具有相对较高的特异性；构建MAGE一的全长和分段原核表达质粒，并分别进行表达，结果显示，MAGE上的全长表达量甚低，而截去前10o个氨基酸残基后M人＊B1乃7习09—)的表达量明显升高：通过对 MAGEA 门)进行原核表达与分离纯化，获得 MAGEJ （194309a）的纯化蛋白，制备 MAGE－l的抗血清，琼脂双扩实验显示，抗血清经1：32稀释后能够与＊＊＊卜1门9个309—)形成抗原抗体沉淀：采用固化 GST蛋白的 Sephrose 4B进行交叉吸附，中和抗血清中针对 GST蛋白的成分后，ELISA表明，抗血清在 1：10，000的情况下能够与抗原结合，Western Blot结果显示抗血清能够与 MAGE．l特异性结合，而不与GST蛋白结合。 工 构建MAGEA的逆转录病毒质粒pLXSN－MAGE刁，经包装细胞PA3包装后，感染小鼠 BI6细胞，经筛选获得 BI6－MAGE－l细胞，RT－PCR检测有 MAGE－l的转录，Western Blot检测到与 MAGE－l抗血清结合的46kDa的蛋白。采用PCR从结核杆菌标准株H37Rv的基因组中克隆HsP70基因，除含有一个苍蝇已突变外其余序列与GeneBank公布的一致；构建MAGE1的真核表达质粒pCDNA－MAGE＊，HSp70的真核表达质粒pCDNA－HSp70，以及二者的融合真核表达质粒pCDNA－MAGE刁；分别采用DNA疫苗免疫C57BL／6 ’J’鼠，采用IFN－Y ELISPOT及培养上清中几上的 ELISA检测结果显示，融合DNA疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中针对 BI6－MAGEJ的特异性 T细胞数量相对于其它各组明显增加中阿对5)；采用LDH释放实验对脾淋巴细胞毒性的检测，结果显示融合 DNA疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞对 BI6．MAGE1细胞的杀伤明显升高，而对以 细胞的杀伤相对于其它组并没有明显变化中＞0刀5人间接ELISA结果显示，融合DNA疫苗免疫的小鼠血清中抗MAGE－l的抗体水平没有明显增高。在小鼠的肿瘤模型的治疗实验中， — —一一显示融合 DNA疫苗对 BI6－MAGE－l肿瘤模型具有良好的治疗作用。 3．分别对HSp70和MAGEq进行原核表达与分离纯化，获得HSp70和MAGE4的纯化蛋白；构建MAGE＊与HSp70融合基因原核表达质粒pGEX－MAGE八，并进行原核表达和分离纯化，获得MAGEq与HSp70的融合蛋白；分别采用蛋白疫苗免疫 C57BL／6小鼠lFN． ELISPOT和IL毛 ELISA检测结果显示，融合蛋白疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中针对B16－MA GEq的T细胞数量明显升高中功．05)；LDH释放实验结果显示，融合蛋白免疫的小鼠，脾淋巴细胞对 BI6－MAGE1的毒性明显增强 b＜0刀5＊而对＊ 细胞的杀伤作用较弱。间接ELISA结果显示，融合蛋白能够提高机体对M人＊E1的抗体水平平＜0刀5人 本研究成功地克隆了MAGE－l的基因，并进行了原核表达，在国内首次制备了 MAGE．1的抗血清，发现 MAGE．l的前 100个氨基酸残基中可能存在的跨膜序列对蛋白的原核表达具有一定的影响。本研究首次构建了MAGE4与HSp70的融合DNA疫苗，研究结果显示其能够激活小鼠的细胞免疫反应，对小鼠肿瘤模型具有良好的治疗作用。融合DNA疫苗对小鼠的体液免疫作用较弱。本研究首次制备了MAGE＊与HSp70的蛋白疫苗，研究结果表明融合蛋白疫苗能够激活小鼠的细胞免疫和体液免疫反应。 综上所述，我们首次构建了MAGE一 融合DNA疫苗及融合蛋白疫苗，两种疫苗均能够激活机体的抗肿瘤免疫效应，此外HSp70作为一种疫苗载体，可明显增强MAGE．l的免疫原性，为新型肿瘤疫苗研究奠定了基础。
董海龙[6]（2003）在《肿瘤抗原MAGE-n HLA-A2限制性CTL表位的预测及鉴定》文中研究表明最近一些年来，已有数个被自身CTL所识别的肿瘤抗原基因被发现，许多由这些肿瘤抗原基因编码的HLA-Ⅰ类分子限制性CTL表位也被相继证实。在这些肿瘤抗原基因中，黑色素瘤抗原（melanoma antigen, MAGE）基因已被证实在许多肿瘤组织中均有表达，而在正常组织中除睾丸外未见表达。MAGE-n为我室首次报道的MAGE家族基因的新成员（GENEBANK登录号AF443295），它与MAGE-A家族基因有较高的同源性且与肝细胞癌（HCC）关系密切。 肝细胞癌是中国和部分亚洲地区最常见的恶性肿瘤之一，对肝细胞癌的治疗尽管已取得一些进展，但对于晚期患者的治疗和预防复发及转移效果仍不理想，免疫治疗目前虽主要作为临床治疗辅助手段，但被认为是最有希望的治疗手段。由于中国HCC患者中HLA-A2比例较高，因此研究HLA-A2限制性的MAGE-n抗原表位以诱导针对HCC细胞的特异性CTL具有十分重要的意义。 在本研究中，我们应用表位预测结合表位重建的方法筛选MAGE-n HLA-A2限制性CTL表位，以筛选到的表位在荷人肝癌SCID小鼠，进行抑瘤实验。结果证实，表位QLVFGIEVV（MAGE-n 159～167）与HLA-A2分子具有高亲和力，同时可从健康HLA-A2供体外周血单个核细胞 （PBMC）诱导特异性 CTL，该 CTL可特异性杀伤表达 MAGE－n的HLA．AZ阳性HCC细胞系，SCID小鼠移植瘤预防及治疗实验显示该表位可在体内产生特异性抗肝癌免疫效应。全文分为以下三个部分：第一韶分：来位预测目的 预测＊＊＊rn抗原的一般生物学特性及＊＊介AZ限制牲＊＊L表位。方法 用SYFPEITHI超基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法，筛选新的MAGE－n抗原HLA－AZ限制性CTL表位作为侯选表位。应用 ANTHEPROT VS刀软件预测 MAGE－n编码蛋臼的一般生物学特性。结果 用表位预测法筛选MAGE七抗原5个HLA－AZ限制性CTL表位（九肽）为侯选表位。MAGE－n抗原的疏水性、亲水性、抗原性、跨膜结构域、等电点及信号肽潜在切割位点同时被预测分析。结论SYFPEITHI超基序法和量化基序多项式法结合的预测方法可提高表位预测的效率及准确性。第二袂分：预测表位的免疫学特性目的 用表位重建技术、ELISPOT及特异性杀伤实验研究HLA－AZ限制性CTL候选表位的结合力及兔疫活性。方洁 对预测的抗原表位进行固相合成，并用HPLC进行纯化，质谱法（MS）鉴定。侯选表位与HLA－AZ位点的亲和力及结合稳定性用竞争结合抑制实验、TZ结合稳定性实验及MHC－肽复合体稳定性实验测定。RT－PCR法检测HCC细胞系MAGE－n表达。脂质体转染法构建MAGE0基因转染细胞系。应用ELISPOT技术检测抗原肽特异性释放IFN＊的T细胞频数。从HLA－AZ阳性健康志愿者外周血分离单个核细胞0BMC)，用TZ细胞负载MAGE0抗原肽反复刺激活化 （每周1次，共4次）诱导抗原肽特异性CTL。乳酸脱氢酶（LDH）释放法测定诱导CTL对表达MAGE0的HLA－AZ阳性HCC细胞的识别及杀伤效 一3一应。结果QLVFGIEVV（159－167），IW盯GFLI（195－203）和FLllVLVMI（20上09）三个表位具有较高的HLA－A二结合力（IC50司卜M）和结合稳定性＊T50＞6h卜 本研究所用HCC细胞株均为HLA－AZ阳性，其中HHCC、BEL7402呈MAGE－n表达阳性。TZ负载MAGE－n／ HLA－AZ抗原肽QLVFGIEVV、FLllVLVMI禾TZ负载Flu／ HLA－AZ抗原肽刺激组释放IFNry效应细胞斑点数平均为167土13．85门’细胞、154士9．65／105细胞及172土15／10’细胞，明显高于单纯TZ刺激组（41 i6／10’细胞）（＜0．05）。22天诱导培养后，效应细胞中CD3＊细胞比例增加到88％，CDS”T细胞比例增加到84O。MAGE－n抗原肽QLVFGIEVV诱导CTL可特异性杀伤表达MAGE．n HLA．AZ阳性细胞系，同时这种特异性杀伤效应可被抗HLA－AZ分子抗体所阻断。结论 本研究证实表位重建技术结合免疫学方法 （ELISPOT，LDH细胞毒实验）可提高表位研究的效率和准确性。实验筛选出的MAGE0抗原表位QLVFGIEVV可作为特异性免疫治疗的靶分子而应用于HLA．AZ阳性肝癌患者免疫治疗。第三部分：荷人肝癌SCID小巨抑回实验目的 研究 MAGE0抗原表位 QLVFGIEVV特异性 CTL对荷人肝癌SCID ’J＼鼠的抑瘤作用。方洁 用 HHCC mLA－AZ”，MAGEfl、细胞皮下接种建立 SCID小鼠荷瘤模型。用 TZ细胞负载抗原肽 QLVFGIEVV反复刺激活化从HLA－AZ阳性健康志愿者外周血单个核细胞（PBMC）诱导抗原肽特异性CTL。动物随机分为3组，分别注射对照培养基（对照组）、CTL（预防组，于接种肝癌细胞前）和 CTL（治疗组，于接种肝癌细胞后）。CTL细胞分别由尾静脉及腹腔注射，每次输注 2．5 XIO乙于接种肿瘤细胞42天测定SCID小鼠脾脏细胞人CD分型。观察各组成瘤率、生长速度、肿瘤体积及重量、肺及其他重要脏器的转移等指标。结果表型分析显示CTL输注动物肿瘤接种42天后脾脏细胞中人CD3”T细胞约 一4?
二、Superantigen-SEA gene modified tumor vaccine for hepatocellular carcinoma:An in vitro study（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Superantigen-SEA gene modified tumor vaccine for hepatocellular carcinoma:An in vitro study（论文提纲范文）
（1）增强树突状细胞及其相关exosome抗肝癌免疫效应的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 第一部分 以单核细胞为前体来源的树突状细胞体外诱导致敏 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 不同来源exosome制备、鉴定及其介导的体外抗肝癌免疫效应 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 黄芪甲苷调节树突状细胞及其exosome抗肝癌免疫作用初探 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 实验主要溶液配制 |
| 综述 |
| 综述一 树突状细胞与肝癌的免疫治疗 |
| 综述一 参考文献 |
| 综述二 Exosome及其相关研究进展 |
| 综述二 参考文献 |
| 致谢 |
（2）RNAi干扰树突状细胞CD40基因对移植排斥反应影响的体外研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 前言 |
| 第一章 综述 |
| 一. 树突状细胞的概述 |
| 二. 树突状细胞的生物学特性 |
| 1. 树突状细胞的分类和来源 |
| 2. 树突状细胞的分离和培养 |
| 三. 树突状细胞的免疫功能 |
| 1. 树突状细胞与免疫激活 |
| 2. 树突状细胞与免疫耐受 |
| 四. 树突状细胞与疾病的免疫治疗 |
| 1. 树突状细胞与肿瘤疾病 |
| 2. 树突状细胞与感染性疾病 |
| 3. 树突状细胞与其它疾病 |
| 五. 树突状细胞与器官移植 |
| 1. 树突状细胞与肝移植 |
| 2. 树突状细胞与肾移植 |
| 3. 树突状细胞与心移植 |
| 六. 树突状细胞的研究及应用前景 |
| 1. 树突状细胞的未来研究方向 |
| 2. 树突状细胞的临床应用展望 |
| 七. 结语 |
| 第二章 DA 大鼠骨髓细胞体外诱导培养树突状细胞 |
| 一. DA 大鼠骨髓细胞体外诱导培养树突状细胞材料与方法 |
| 二. 树突状细胞形态学观察 |
| 三. 树突状细胞的表型检测 |
| 四. 结果 |
| 五. 结论 |
| 六. 讨论 |
| 第三章 大鼠CD4-siRNA 慢病毒载体制备与鉴定 |
| 第一节 材料和方法 |
| 第二节 实验方法 |
| 一. 目的基因RNA 干扰慢病毒载体制备 |
| 二. CD40的RNAi目的基因与pGCL-GFP质粒载体的连接 |
| 三. 阳性克隆质粒抽提 |
| 四. 慢病毒小量包装 |
| 五. 慢病毒大量包装 |
| 第三节 RNA干扰有效靶点筛选-WesternBlot筛靶 |
| 一. 实验目的 |
| 二. 实验设计 |
| 三. 表达rat CD40的293T细胞制备 |
| 四. 阳性克隆质粒抽提 |
| 五. 融合蛋白质粒转染293T细胞 |
| 六. 有效靶点筛选 |
| 第四节 实验结果 |
| 第四章 CD40-RNAi 慢病毒载体转染 DC 细胞 |
| 第一节 CD40-RNAi 慢病毒载体转染DC 细胞方法 |
| 第二节 CD40-RNAi 慢病毒载体转染DC 细胞Real-time PCR 检测 |
| 第三节 CD40-RNAi 慢病毒载体转染DC 细胞Western blot 检测 |
| 第四节 实验结果 |
| 一. 荧光显微镜下形态学检测见附图(A B C D) |
| 二. CD40-siRNA 慢病毒转染DC 的Real-time PCR 检测结果 |
| 三. 带siRNA 慢病毒转染DC 的western blot 检测结果 |
| 第五节 讨论 |
| 第五章 RNAi干涉后的DC对大鼠淋巴细胞增殖影响的体外实验 |
| 一. 材料和方法 |
| 二. 结果及讨论 |
| 第六章 讨论 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
（3）肿瘤基因工程纳米疫苗的研制及抗肿瘤效应的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验研究 |
| 实验一 纳米乳剂的制备及性质鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 肿瘤蛋白疫苗复合抗原的制备及其生物活性分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 肿瘤基因工程纳米疫苗的制备及抗肿瘤效应研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四 肿瘤基因工程纳米疫苗表面修饰的初步研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（4）HCV C-Fc融合基因疫苗修饰的树突状细胞功能研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言和文献回顾 |
| 正文 |
| 第一部分 HCV-Fc基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 一. pcDNA3HCV-Fc融合基因载体的构建和表达 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 二. 树突状细胞的分离培养、体外活化和鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 三、 HCV C-FC融合基因转染树突状细胞及其功能研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 HCV-Fc基因转染树突状细胞疫苗的功能 |
| 一. HCV-Fc基因修饰DC疫苗的抗HCV免疫作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 二. HCV-Fc基因修饰DC疫苗抗移植瘤免疫作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（5）热休克蛋白70与MAGE-1融合基因疫苗和蛋白疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验材料 |
| 实验一 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（6）肿瘤抗原MAGE-n HLA-A2限制性CTL表位的预测及鉴定（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 实验材料 |
| 第一部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、Superantigen-SEA gene modified tumor vaccine for hepatocellular carcinoma:An in vitro study（论文参考文献）
- [1]增强树突状细胞及其相关exosome抗肝癌免疫效应的实验研究[D]. 吴尘轩. 天津医科大学, 2008(12)
- [2]RNAi干扰树突状细胞CD40基因对移植排斥反应影响的体外研究[D]. 苏纪权. 吉林大学, 2007(05)
- [3]肿瘤基因工程纳米疫苗的研制及抗肿瘤效应的研究[D]. 孙玉静. 第四军医大学, 2005(06)
- [4]HCV C-Fc融合基因疫苗修饰的树突状细胞功能研究[D]. 王全楚. 第四军医大学, 2004(04)
- [5]热休克蛋白70与MAGE-1融合基因疫苗和蛋白疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究[D]. 叶菁. 中国人民解放军第四军医大学, 2003(03)
- [6]肿瘤抗原MAGE-n HLA-A2限制性CTL表位的预测及鉴定[D]. 董海龙. 中国人民解放军第四军医大学, 2003(01)