一、大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡情况及缺血预处理对其影响（论文文献综述）
李晨[1]（2021）在《电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用》文中研究说明目的 基于“中医治未病”思想及“心胸内关谋”经典理论,在前期研究基础上,以心肌缺血再灌注损伤模型大鼠为研究对象,从细胞凋亡、细胞焦亡以及细胞自噬的角度出发,观察电针“内关”“足三里”“关元”穴预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其作用机制。并借用FXR/SHP凋亡信号通路激动剂GW4064及抑制剂Z-guggulsterone从FXR/SHP信号转导通路的角度探讨其作用机制,以及细胞凋亡、焦亡和自噬的联系,为电针预处理防治MIRI提供新的理论依据和治疗靶点。方法 一理论探讨:以中医学和现代医学理论为基础,从心肌细胞焦亡、自噬及凋亡角度出发,探讨电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及其机制;从FXR/SHP凋亡信号通路的角度出发,探讨FXR/SHP通路对心肌细胞凋亡、焦亡以及自噬的影响及其作用机制,以及三者间的联系。二动物实验:将Wistar大鼠80只（雄性,SPF级）按照“随机数字表法”进行随机分组,平均分为4组,分别是:正常组（N组）、假手术组（S组）、模型组（M组）和电针预处理组（EA组）,20只为一组。所有实验动物适应性喂养1周后,开始正式实验。通过左侧冠状动脉结扎法制备MIRI大鼠模型,每组大鼠给予相应的干预措施。再增加40只Wistar大鼠（雄性,SPF级）,随机分为2组,每组20只,分别为电针+GW4064激动剂组（EA+GW组）和电针+z-Guggulsterone抑制剂组（EA+Z组）,每组大鼠给予相应的干预措施。实验1:采用HE染色观察各组心肌组织的形态结构;采用TTC染色测量各组心肌梗死面积和心肌梗死质量;采用TUNEL染色计算各组心肌细胞凋亡指数,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法（ELISA法）进行各组心肌损伤标志物（LDH、CK和c Tn I）的测定;从而探讨电针预处理对MIRI大鼠的保护作用。实验2:采用Western-blot法检测各组NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白等焦亡相关指标的表达,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞焦亡通路的调节作用实验3:采用Western-blot法检测各组Beclin1、LC3I、LC3Ⅱ蛋白表达以及LC3Ⅱ/LC3I比值,研究电针预处理对心肌细胞的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞自噬通路的调节作用。实验4:采用Western-blot法检测各组Bcl-2、Bax蛋白表达,同时用荧光定量PCR法检测各组Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,研究电针预处理对MIRI大鼠模型的保护作用,初步探讨电针预处理对MIRI大鼠心肌细胞凋亡通路的调节作用。实验5:采用TUNEL染色法计算各组心肌细胞凋亡指数,采用荧光定量PCR法检测凋亡相关指标FXRm RNA、SHPm RNA表达,采用Western-blot法检测各组凋亡相关指标Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达,焦亡相关指标Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达以及自噬相关指标Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,探讨电针预处理对MIRI模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响,以及FXR/SHP信号通路对细胞凋亡、焦亡、自噬的影响及三者间的联系。结果 实验1电针预处理对MIRI大鼠心肌损伤标志物、心肌细胞凋亡指数及形态学影响（1）HE染色:光镜下观察与比较各组大鼠心肌细胞形态学结果如下:N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。N组和S组大鼠心肌纤维走向整齐,横纹清晰可见,细胞结构完整,形态正常,无炎性浸润,细胞核位置正常,无空泡样变性;M组心肌纤维走形紊乱、可见心肌纤维断裂现象,心肌细胞结构不完整,炎性细胞浸润明显,可见空泡样变性;EA组大鼠心肌组织大体形态正常,破坏减轻,心肌纤维排列稍显杂乱,少许纤维断裂,少量炎性细胞浸润,少量细胞水肿坏死。表明电针预处理能有效缓解心肌缺血再灌注模型大鼠心肌组织损伤。（2）心肌梗死面积:与N组相比较,S组梗死面积变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死面积显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死面积显着减小（P<0.01）。（3）心肌梗死质量;与N组相比较,S组梗死质量变化不大,差异无统计学意义（P>0.05）;与N组相比较,M组的梗死质量显着增加（P<0.01）;与M组相比较,EA组的梗死质量显着减小（P<0.01）。（4）心肌细胞凋亡指数:N组和S组心肌组织中,可见极少量凋亡细胞核,M组中存在大量凋亡细胞,细胞核形态不规则,成碎片状,EA组可见少量凋亡细胞核。与N组和S组比较,M组心肌细胞凋亡指数明显上升（P<0.01）,与M组比较,EA组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.01）。（5）血清LDH、CK、c Tn I含量:与N组相比较,S组血清LDH、CK、c Tn I含量变化不大,差异均无统计学意义（均P>0.05）;与N组比较,M组、EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均上调（均P<0.01）,EA组血清LDH、CK、c Tn I含量均低于M组（均P<0.01）。实验2电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠焦亡通路的调控作用（1）心肌组织NLRP3、ASC蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的NLRP3、ASC蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组NLRP3、ASC蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。（2）心肌组织Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达情况:与N组、S组相比较,M组、EA组的Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达均显着下降（均P<0.05）。实验3电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠自噬通路的调控作用（1）心肌组织Beclin-1蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Beclin-1蛋白表达明显升高（P<0.05）,与M组相比,EA组Beclin-1蛋白表达明显降低（P<0.05）。（2）心肌组织LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（P<0.05）。实验4电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠细胞凋亡的影响（1）心肌组织Bcl-2蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）。与M组比较,EA组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）。（2）心肌组织Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组和EA组Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达显着升高（均P<0.05）,与M组比较,EA组的Caspase-9m RNA、Caspases-3m RNA及Bax蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。实验5电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP信号通路的影响（1）心肌细胞凋亡指数:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组心肌细胞凋亡指数均明显降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组心肌细胞凋亡指数明显下降（P<0.05）,EA+GW组心肌细胞凋亡指数明显升高（P<0.05）。（2）心肌组织FXRm RNA、SHPm RNA表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组及EA+GW组大鼠心肌细胞FXRm RNA、SHPm RNA表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组、EA+Z组的FXRm RNA、SHPm RNA表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组FXR、SHPm RNA表达水平显着降低（P<0.05）,EA+GW组FXR、SHPm RNA表达水平明显升高（P<0.05）。（3）心肌组织Bcl-2、Bax、Caspases-3蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GM组及EA+Z组大鼠心肌细胞Bcl-2蛋白表达水平均下降（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均显着升高（均P<0.05）。与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Bcl-2蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）,Bax、Caspase-3蛋白表达水平均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Bcl-2蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,EA+GW组Bax、Caspases-3蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）。（4）心肌组织Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显升高（均P<0.05）,与M组相比,EA组、EA+GW组及EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明显降低（均P<0.05）,与EA组比较,EA+Z组Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。（5）心肌组织Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达情况:与N组、S组比较,M组、EA组、EA+GW组及EA+Z组大鼠心肌细胞Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均明显升高（均P<0.05）;与M组比较,EA组、EA+GW组及EA+Z组的Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达均有显着性降低（均P<0.05）;与EA组比较,EA+Z组Gasdermin D、IL-1β、IL-18蛋白表达水平均显着降低（均P<0.05）,EA+GW组均显着升高（均P<0.05）。结论 1.电针预处理能使MIRI模型大鼠心肌梗死面积及梗死程度明显下降,降低凋亡指数,病理形态学检测提示电针可显着改善受损心肌组织的病理损害程度。2.电针预处理能下调MIRI模型大鼠血清中LDH、CK及c Tn I的含量,保护大鼠心肌组织。3.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1、Gasdermin D蛋白表达,通过抑制细胞焦亡,保护心肌组织。4.电针预处理能抑制MIRI模型大鼠Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值过度升高,通过抑制细胞过度自噬,保护心肌组织。5.电针预处理能下调MIRI模型大鼠Bax蛋白表达、Caspases-9m RNA、Caspases-3m RNA表达,上调Bcl-2蛋白表达,通过抑制细胞凋亡,保护心肌组织。6.电针预处理能通过抑制FXR/SHP凋亡信号通路从而抑制心肌细胞凋亡,抑制凋亡,能起到抑制细胞焦亡和抑制细胞过度自噬的作用,从该角度探讨三者间的联系,进一步说明电针预处理对MIRI的保护机制可能是多层次、多途径的综合效应。
夏君彦[2]（2021）在《益气活血中药调节线粒体自噬改善心肌细胞缺氧复氧损伤的机制研究》文中认为研究背景及目的:心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI）是指恢复缺血心肌组织的血液灌注及氧供后反而加重心肌组织损伤的现象,其与缺血诱导的损伤共同决定最终的心肌梗死面积。有研究显示MIRI可占全部梗死心肌面积的50%。如何有效减轻MIRI,对于减少再灌注治疗术后并发症、提高生存率,具有重要的临床价值。目前研究表明,线粒体自噬对维持心肌细胞内环境稳态具有重要作用,通过调节线粒体自噬水平,可有效减轻MIRI。中医药在改善MIRI中具有较好前景,有临床研究显示,中药能明显改善经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention,PCI）术后急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI）患者的射血分数（ejection fraction,EF）、左室每搏量（stroke volume,SV）等心功能指标,降低术后肌酸激酶（creatine kinase,CK）和肌酸激酶同工酶（creatininekinase-MBisoenzyme,CK-MB）峰值水平,减少心绞痛的发作次数及程度,减少恶性心律失常及主要心血管不良事件发生率。有研究表明,益气活血中药及其复方对再灌注心肌的保护作用优于单用益气药或活血药,且具有多组分多靶点的协同作用。本研究在查阅文献和前期研究基础上,拟通过H9C2心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤模型,运用siRNA转染、激光共聚焦技术、腺病毒感染、RT-PCR及Western Blot等方法,从细胞、分子层面,围绕心肌细胞的损伤、线粒体损伤、线粒体自噬、自噬流等方面进行研究,以验证“益气活血中药配伍{三七总皂苷（PNS）+西洋参茎叶总皂苷（PQS）}可能通过HIF-1α/BNIP3通路介导的线粒体自噬发挥抗心肌细胞H/R损伤作用”假说的科学性。研究方法:1.制备H9C2心肌细胞H/R损伤模型:细胞融合度达70%以上后,预热PBS清洗1次,加入低糖无血清培养液,置于三气孵箱中（37℃,5%CO2,1%O2,94%N2,湿度≥95%）缺氧培养4h,更换为完全培养液于37℃5%CO2孵箱中复氧培养2h,4h,6h,CCK-8法检测不同复氧时间对H9C2心肌细胞的增殖影响。2.药物最佳剂量筛选:将PQS与PNS配置成40mg/ml、80mg/ml、160mg/ml的储存液,于H/R前12h将储存液1000倍稀释以1:1比例加入完全培养液中含药培养细胞,造模后用CCK-8法检测不同药物浓度对心肌细胞H/R损伤的增殖影响。3.siRNA脂质体转染以沉默目标基因BNIP3:用RT-PCR法检测转染时间分别为12h,24h,48h时siRNA转染效率,并筛选出最佳siRNA序列。4.分组及给药:分为5组:Control组、H/R组、H/R+PQS+PNS组、H/R+PQS+PNS+siBNIP3 组、H/R+PQS+PNS+siNC 组5.Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡率,JC-1染色检测ΔΨm,DCFH-DA染色检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量,Mitosox Red染色检测线粒体ROS含量,透射电镜下观察自噬水平及线粒体超微结构,以证实益气活血中药配伍（PNS+PQS）减轻心肌细胞H/R损伤的作用,及对线粒体损伤的保护作用。6.以mRFP-GFP-LC3腺病毒感染H9C2心肌细胞,激光共聚焦显微镜下观察细胞内自噬体数目及自噬溶酶体数目,判断益气活血中药配伍（PNS+PQS）对H/R损伤心肌细胞内自噬流的影响。7.Real time-PCR检测各组细胞间HIF-1α和BNIP3 mRNA表达情况。8.Western blot检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin1及线粒体自噬相关蛋白HIF-1a、BNIP3 表达情况。研究结果:I.CCK-8:与 Control 组相比,H/R 组 OD 值降低（P<0.01）;与单药 PQS、PNS 两组相比,H/R+PQS+PNS 组 OD 值升高（P<0.05）。2.流式细胞凋亡率:与Control组相比,H/R组H9C2心肌细胞凋亡率明显升高（P<0.05）;与 H/R 组相比,H/R+PNS+PQS 组、H/R+PNS+PQS+siBNIP3 组、H/R+PNS+PQS+siNC组细胞凋亡率得到显着改善（P<0.01）。ΔΨm:H/R组相较于Control 组△Ψm显着下降（P<0.01）;H/R+PNS+PQS 组、H/R+PNS+PQS+siBNIP3 组、H/R+PNS+PQS+siNC组相较于H/R组ΔΨm明显升高（P<0.01）。细胞内ROS含量:与Control组相比,H/R组细胞内ROS产生明显升高（P<0.01）;与H/R组相比,H/R+PNS+PQS 组、H/R+PNS+PQS+siBNIP3 组、H/R+PNS+PQS+siNC 组细胞内 ROS 产生明显减少（P<0.01）。线粒体ROS含量:与Control组相比,H/R组细胞线粒体ROS产生明显升高（P<0.01）;与 H/R 组相比,H/R+PNS+PQS 组、H/R+PNS+PQS+siBNIP3组线粒体ROS产生明显减少（P<0.01）。3.mRFP-GFP-LC3腺病毒感染观察自噬流:与Control组相比,H/R组自噬体数量明显升高（P<0.05）;与 H/R 组相比,H/R+PNS+PQS 组、H/R+PNS+PQS+siBNIP3 组、H/R+PNS+PQS+siNC组心肌细胞内自噬溶酶体数量显着升高（P<0.01）。透射电镜观察细胞自噬水平及线粒体超微结构:与Control组相比,H/R组自噬水平明显升高（P<0.01）;与 H/R 组相比,H/R+PNS+PQS 组自噬水平明显下降（P<0.05）,H/R+PNS+PQS+siBNIP3组、H/R+PNS+PQS+siNC组自噬水平有下降趋势（P>0.05）。与Control组相比,H/R组线粒体外形肿胀、嵴型异常表现,具有双层膜结构的自噬体数量增多（P<0.01）;与H/R组相比,H/R+PNS+PQS 组、H/R+PNS+PQS+siBNIP3 组、H/R+PNS+PQS+siNC 组可见线粒体超微结构改善,线粒体外形肿胀减轻,嵴型较为完整。4.RT-PCR:与Control组相比,H/R组HIF-1α的mRNA表达量明显升高（P<0.01）;与H/R组相比,H/R+PNS+PQS组HIF-1a的mRNA表达量显着下降（P<0.01）;与H/R+PNS+PQS 组相比,H/R+PNS+PQS+siBNIP3组HIF-1α的mRNA 表达量明显升高（P<0.01）。与Control组相比,H/R组BNIP3的mRNA表达量明显升高（P<0.01）;与H/R组相比,H/R+PNS+PQS组BNIP3的mRNA表达量显着下降（P<0.01）;与H/R+PNS+PQS+siBNIP3 组相比,H/R+PNS+PQS 组和 H/R+PNS+PQS+siNC 组 BNIP3 的mRNA 表达量明显升高（P<0.01）。Western blot:LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin1、HIF-1α、BNIP3蛋白表达水平组间比较差异均无统计学差异（P>0.05）。结论:1.益气活血中药配伍（PNS+PQS）能减轻心肌细胞H/R损伤,其共同作用效果优于单药PNS或PQS。2.益气活血中药配伍（PQS+PNS）能减少H/R损伤心肌细胞凋亡率、维持ΔΨm、减少胞内及线粒体ROS含量、保护线粒体结构。3.益气活血中药配伍（PQS+PNS）可能通过降低过度激活的自噬水平,增加自噬溶酶体的生成、畅通自噬流,发挥抗心肌细胞H/R损伤的作用。4.益气活血中药配伍（PQS+PNS）对H/R损伤心肌的保护作用可能与下调HIF-1a/BNIP3通路介导的线粒体自噬相关。
张静[3]（2020）在《OGT介导的RIPK3 O-GlcNAc糖基化在七氟醚后处理抑制心肌缺血再灌注损伤时程序性坏死中的作用》文中指出背景和目的:吸入麻醉药对心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）能够发挥明确的心肌保护作用。之前研究已经明确吸入麻醉通过O-Glc NAc糖基化修饰线粒体电压依赖性阴离子通道,发挥对MIRI的保护作用。O-Glc NAc糖基化修饰对心肌细胞程序性坏死具有保护作用。虽然目前临床上有多种挥发性麻醉药应用,但是在心胸外科手术中使用最为广泛的挥发性麻醉药仍是七氟醚。心胸外科手术强调围术期,尤其是麻醉诱导和麻醉苏醒阶段的血流动力学平稳,而七氟醚的药效特点能与此吻合。之前有大量的临床和基础课题关注于七氟醚后处理（sevoflurane postconditioning,SPC）的心肌保护作用,但就其保护作用的机制研究并不够全面。本研究的目的是探讨OGT介导的RIPK3 O-Glc NAc糖基化上调和程序性坏死信号通路下调是否是SPC发挥心肌保护作用的重要机制。方法:本研究建立在体和离体MIRI模型,并将在体模型中60只大鼠随机分为四组:假手术组（SHAM组）,单纯七氟醚组（SEVO组）,缺血再灌注组（IR组）和七氟醚后处理组（SPC组）。在Langendorff离体模型中45只大鼠随机分为五组:SHAM组,IR组,SPC组,SPC+溶剂（DMSO）组,SPC+抑制剂（OSMI-1）组。其中除SHAM组和SEVO组外,其它各组每只大鼠心脏均经历持续缺血30min后恢复血流2h的过程。实验过程中持续监测大鼠血流动力学变化,并在平衡期末（T0）,恢复血流后30min（T1）,恢复血流后60min（T2）,恢复血流后90min（T3）,恢复血流后2h（T4）时进行记录。利用小动物心脏彩超仪监测在体实验中各组大鼠心功能指标。在再灌注末,利用1%氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色检测心肌梗死范围,参照酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）法检测血清或冠脉漏出液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）浓度,利用HE染色后光镜下观察各组大鼠的心肌组织病理片,利用荧光显微镜观察程序性坏死的心肌,利用Western Blot方法检测O-Glc NAc糖基化水平和程序性坏死标记蛋白的表达水平。另外,为了进一步的机制研究,通过免疫共沉淀技术检测O-Glc NAc糖基化蛋白和程序性坏死信号通路相关蛋白之间的结合情况。结果:1、在体MIRI模型中,通过监护仪连续监测并记录大鼠T0、T1、T2、T3和T4不同时间点四组大鼠HR、MAP和RPP,结果显示SPC改善了MIRI后的血流动力学变化;2、在体MIRI模型中,利用小动物心脏超声仪采集大鼠超声心动图并测量心功能参数,表明SPC能够改善IR损伤后的心脏收缩功能不全,减轻心脏结构的改变和逆转心室肥厚;3、在体MIRI模型中,检测各组大鼠心肌梗死范围和HE染色的结果表明SPC能够降低IR损伤后的大鼠心肌梗死范围,改善IR损伤后心肌细胞紊乱排列;4、在体MIRI模型中,监测血清LDH浓度,发现SPC能够降低IR损伤后血清心肌程序性坏死标记酶LDH浓度;5、在体MIRI模型中,通过荧光显微镜观察程序性坏死的心肌细胞,结果表明SPC能够降低IR损伤后的程序性坏死心肌细胞;6、在体MIRI模型中,检测程序性坏死相关蛋白的结果表明SPC能够下调p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL和MLKL蛋白表达水平;7、在体MIRI模型中,检测O-Glc NAc糖基化蛋白的结果表明SPC能够上调IR损伤后总蛋白O-Glc NAc糖基化和OGT蛋白表达水平;8、在体MIRI模型中,通过蛋白免疫共沉淀实验检测心肌细胞中O-Glc NAc、RIPK3和MLKL之间是否存在相互作用,结果表明SPC能够上调IR损伤后O-Glc NAc糖基化RIPK3,并且抑制RIPK3和MLKL的结合;9、离体MIRI模型中,通过监护仪连续监测并记录大鼠T0、T1、T2、T3和T4不同时间点五组大鼠HR、LVSP、LVEDP和±dp/dtmax,结果显示SPC改善了MIRI后的血流动力学,但给予OGT抑制剂OSMI-1后减弱了SPC改善血流动力学的心肌保护作用;10、离体MIRI模型中,通过1%TTC染色测定心肌梗死范围,结果表明SPC能够减少IR损伤后的心肌梗死范围,但给予OSMI-1后减弱了SPC降低心肌梗死的心肌保护作用;11、离体MIRI模型中,监测冠脉漏出液LDH浓度,发现SPC能够降低IR损伤后冠脉漏出液LDH浓度,但给予了OSMI-1后冠脉漏出液LDH浓度明显升高;12、离体MIRI模型中,检测糖基化相关蛋白的结果表明SPC能够上调IR损伤后总蛋白O-Glc NAc糖基化和OGT蛋白表达水平,但给予OSMI-1后总蛋白O-Glc NAc糖基化和OGT蛋白表达水平明显下调;13、离体MIRI模型中,检测程序性坏死相关蛋白的结果表明SPC能够下调p-RIPK3和p-MLKL蛋白表达水平,但给予OSMI-1后p-RIPK3和p-MLKL蛋白表达水平均明显上调。结论:1、SPC通过抑制MIRI时RIPK3/MLKL介导的程序性坏死发挥心肌保护作用;2、SPC通过促进MIRI时OGT介导的O-Glc NAc糖基化修饰水平升高,进一步增加RIPK3的O-Glc NAc糖基化修饰水平;3、SPC能够上调MIRI时RIPK3的O-Glc NAc糖基化水平,进而抑制RIPK3/MLKL复合物形成,最终减轻MIRI所致的程序性坏死。
肖燕[4]（2020）在《基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究》文中研究说明目的:1、比较不同电流强度电针预处理（EAP）对心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的影响,并明确其效应差异,探索EAP抗MIRI的相对适宜电流强度。2、探索mTORC1在EAP抗MIRI保护效应中与线粒体自噬的相关性。3、探索EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制。方法:1、将120只SPF级成年雄性SD大鼠随机分为8组:模型组（I/R组）、模型+非电针对照组（I/R+SEA组）、模型+0.2mA电流强度电针预处理4d组（I/R+0.2mA组）、模型+1mA电流强度电针预处理4d组（I/R+1mA组）、模型+2mA电流强度电针预处理4d组（I/R+2mA组）、模型+4mA电流强度电针预处理4d组（I/R+4mA组）、模型+6mA电流强度电针预处理4d组（I/R+6mA组）、模型+8mA电流强度电针预处理4d组（I/R+8mA组）,每组各15只。各电针预处理组分别于MIRI手术前4天（d）干预,选择大鼠双侧“内关”穴（PC6）进行电针（2/100Hz）,20min/次,1次/d。I/R+SEA组每天进行与其他组相同方式、时间的异氟烷吸入麻醉但不电针。各组均于第5d结扎心脏冠状动脉左前降支（LAD）30min,再灌注4h,建立心肌缺血再灌注损伤模型,期间进行心电图（ECG）监测。每天监测大鼠体重变化,再灌注4h后,统计室性心律失常评分（VAS）情况,并对各组大鼠生存情况进行生存曲线分析;采用Evans blue-TTC双染法染色切片,计算心肌梗死面积比（Infarct size,IS%）、风险面积比（Risk size）;利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测血清肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌钙蛋白T（cTnT）的浓度。2、在探索了电针预处理抗MIRI的相对适宜电流强度基础上,进行实验二和实验三。实验二将140只SPF级成年雄性SD大鼠,随机分为5组,分别为:假手术组（S组）,除不结扎LAD,余与模型组操作相同;假手术+电针预处理组（S+EA组）,除不结扎LAD,余与模型+电针预处理组操作相同;模型组（I/R组）,同“方法1”中的造模方法;模型+非电针预处理组（I/R+SEA组）,在大鼠两侧PC6皮肤表面贴上与电针同样大小的自制的竹制签子20min/次/d,连续4d,第5天造模;模型+电针预处理组（I/R+EA组）,每天电针1次（2mA,2/100Hz,20min）,连续4d,第5天造模。每组各28只。实验三将196只SPF级成年雄性SD大鼠,随机分为7组,分别为:I/R组,同上;I/R+EA组,同上;空白对照组（B组）,未做干预处理;模型+阴性对照预处理组（I/R+C组）,腹腔注射与抑制剂组等量的助溶剂,1次/d,连续4d,并于第5天造模;模型+阴性对照+电针预处理组（I/R+C+EA组）,每天电针1次、腹腔注射与抑制剂组等量的助溶剂1次,连续4d,第5天造模;模型+mTORC1抑制剂（雷帕霉素,Rapamycin）预处理组（I/R+R组）,腹腔注射雷帕霉素,每天1次,3.0mg/kg,连续3d,并于最后1次注射24h后造模;模型+mTORC1抑制剂+电针预处理组（I/R+R+EA组）,每天电针1次,连续4d;电针第2天,同时开始给予腹腔注射雷帕霉素,每天1次,连续3d,于最后1次注射24h后造模。每组各28只。每天监测大鼠体重变化,并在实验结束后对各组大鼠生存情况进行生存曲线分析;采用ECG检测心脏ST段变化,并对缺血期的前20min和再灌注期的前20min及220-240min进行VAS统计;Evans blue-TTC双染色法观察心肌梗塞面积情况,计算IS%与Risk size;ELISA法测定血清心肌酶谱CK-MB、LDH、cTnT的水平;采用末端脱氧核苷酰转移酶介导的DUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌细胞凋亡,评价心肌细胞存活情况,全面充分评价心脏功能情况。在充分明确EAP对MIRI保护效应的基础上,采用透射电镜观察自噬囊泡（即自噬小体）水平;免疫荧光染色法检测线粒体、溶酶体及两者结合情况,评价EAP抗MIRI效应与线粒体自噬的相关性。采用蛋白免疫印迹（WB）、免疫组化法（IHC）分别检测心肌组织线粒体中LC3-I（mito-LC3-I）与LC3-Ⅱ（mito-LC3-Ⅱ）、心肌中mTORC1、ATG13、ULK1、p-ULK1、FUNDC1、p-FUNDC1等物质的分布和表达水平;采用大鼠能量（ATP）ELISA试剂盒检测左心室心肌组织中线粒体的ATP产生情况,整体分析EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路调控线粒体自噬从而减轻MIRI的可能潜在机制。结果一:不同电流强度EAP对MIRI的效应差异1、不同电流强度EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响各组大鼠体重变化表明,EAP电流强度为0.2mA、1mA与2mA时,EAP的大鼠体重呈正常增长趋势,而电流强度为4mA、6mA、8mA时大鼠体重随着EAP电流强度的增大,体重出现不增反减的趋势;对生存曲线的分析结果显示,与I/R组比,EAP各组的存活率均升高,但0.2mA、1mA与2mA时的大鼠术后存活率高于4mA、6mA与8mA组。2、不同电流强度EAP抗MIRI的效应研究大鼠VAS、心脏Evans blue-TTC双染色及血清心肌酶谱结果表明,与I/R组比,不同电流强度EAP均可有效降低MIRI。VAS结果显示,EAP（仅I/R+2mA组）可有效降低室性心律失常评分VAS（P<0.05）。Evans blue-TTC染色结果显示,与I/R组比,EAP（I/R+0.2mA 组、I/R+1mA 组、I/R+2mA 组、I/R+4mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组）可明显降低 IS%、Risk size（P<0.05）,其中 I/R+2mA 组的 IS%、Risk size 值最小（P<0.05）;而与 I/R+2mA 组相比,I/R+4mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组的 IS%增加（P<0.05）,其中 I/R+6mA 组、I/R+8mA 组 IS%显着增加（P<0.01）。与 I/R+2mA 组相比,I/R+SEA 组、I/R+0.2mA 组、I/R+1mA 组、I/R+6mA 组、I/R+8mA 组心肌 Risk size 均增加（P<0.05）。血清心肌酶谱结果表明,与I/R组比,不同电流强度EAP均可有效降低血清CK（P<0.05）、CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平。其中 I/R+2mA 组的心肌酶谱水平均最低,效应最佳。结果二:EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的效应研究1、EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响各组大鼠体重及术后生存曲线的结果表明,与I/R组比,EAP可促进大鼠体重稳步增长,并有效提高大鼠MIRI术后存活率。2、对 VAS、IS%及 Risk size 的影响结果显示,与I/R组比,EAP可有效降低VAS（P<0.05）、降低IS%（P<0.05）及Risk size（P<0.05）。3、EAP减少MIRI诱导的心肌损伤标志物和细胞凋亡结果显示,与I/R组比,I/R+EA组可降低血清CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平,减少心肌细胞凋亡（P<0.05）,从而减轻MIRI,对心脏起到保护作用。4、EAP减弱MIRI诱导的线粒体自噬与S组相比,I/R和I/R+SEA组的自噬囊泡明显增加（P<0.01）。与I/R组相比,EAP（I/R+EA组）显着减少了再灌注240min后心肌组织自噬囊泡的数量（P<0.05）,即EAP可抑制线粒体与溶酶体的结合。5、EAP 调节 mTORC1、ULK1 和 FUNDC1 的表达采用WB、IHC检测心肌组织中的mTORC1、ULK1、FUNDC1蛋白表达,结果初步显示,EAP可促进mTORC1蛋白的表达,抑制线粒体自噬相关蛋白ULK1、FUNDC1的表达水平。结果三:EAP调控MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制研究1、雷帕霉素阻断了 EAP的心脏保护作用各组大鼠体重及术后生存曲线的结果表明,在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP促进MIRI大鼠体重稳步增长,并有效提高大鼠MIRI术后存活率这一保护作用。在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP对MIRI的保护效应:与I/R组比,I/R+R+EA组的VAS升高（P<0.05）、IS%（P<0.05）及Risk size（P<0.05）也升高、血清CK-MB（P<0.05）、LDH（P<0.05）、cTnT（P<0.05）的水平均升高,心肌细胞凋亡率也增加（P<0.05）。2、雷帕霉素减弱EAP抑制的线粒体自噬结果显示,在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,消除了 EAP对MIRI线粒体自噬的抑制效应:I/R+R+EA组的自噬囊泡水平（P<0.05）升高,线粒体与溶酶体的结合（P<0.05）增加,表明线粒体自噬的水平增加,从而使MIRI加重。3、EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1途径抑制线粒体自噬WB、IHC检测mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路中的相关蛋白:心肌组织mTORC1、ATG13、p-ULK1、ULK1、p-FUNDC1、FUNDC1 及心肌线粒体中 mito-LC3Ⅰ、mito-LC3Ⅱ,结果显示,EAP可促进mTORC1蛋白的表达,抑制线粒体自噬相关蛋白ATG13、p-ULK1、ULK1、p-FUNDC1、FUNDC1、mito-LC3Ⅱ/Ⅰ 的表达水平（全部,P<0.05）,但在应用雷帕霉素抑制mTORC1蛋白后,EAP的这些调节作用则受到抑制（P<0.05）。对ATP（三磷酸腺苷）检测水平的结果显示,心肌缺血再灌注损伤后FUNDC1蛋白诱导的线粒体自噬会通过过度消除线粒体而增加心肌细胞凋亡（P<0.05）,线粒体数量的绝对不足而导致ATP产生障碍。但在PC6上进行EAP可逆转这种情况:EAP可促进线粒体内ATP的产生（P<0.05）,防治MIRI。而应用雷帕霉素后,EAP的这一促进作用则受到抑制。结论:1、不同电流强度EAP“内关”穴4天均可有效抗MIRI,其中2mA电流强度的EAP保护效应最好。2、EAP“内关”穴减轻MIRI大鼠的心肌保护效应可能与其促进心肌组织mTORC1蛋白的表达,同时下调ULK1、FUNDC1蛋白的表达,从而抑制线粒体自噬的发生有关。说明mTORC1在EAP抗MIRI中可能起关键性的作用。3、雷帕霉素抑制mTORC1后消除了 EAP“内关”穴对MIRI大鼠的心肌保护效应,说明EAP对MIRI的心肌保护效应可能是通过mTORC1-ULK1-FUNDC1这一信号通路调控线粒体自噬,进而增加线粒体来源的ATP,改善MIRI后的能量供应来实现的。
刘岩松[5]（2020）在《基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制》文中进行了进一步梳理目的:院内制剂舒心生脉丹,是三十多年临床经验总结得出的经验方,在治疗冠心病为代表的心血管疾病方面疗效确切。为进一步探讨其作用机制,本课题通过病理学、分子生物学等分析方法,探索其对心肌细胞的保护机制,探讨其与细胞凋亡相关性,运用实验数据评价舒心生脉丹的疗效,为舒心生脉丹新药研发提供数据支持,为中医治疗心血管疾病的临床药物应用以及疾病治疗提供有价值的理论依据。方法:1.将70只健康SPF级SD雌性大鼠随机分成7组:空白组、假手术组、阳性对照组（复方丹参滴丸）、模型组、舒心生脉丹低剂量组、舒心生脉丹中剂量组、舒心生脉丹高剂量组。2.中药预处理:适应性饲养5天后,分组给药。给药剂量:根据动物与人之间药物等效剂量换算系数表计算,舒心生脉丹中剂量组为健康成年人1日用量,舒心生脉丹高剂量组与舒心生脉丹低剂量组分别为2倍剂量与0.5倍剂量,对照组复方丹参滴丸按照健康成年人1日用量给药。预给药7天,每日给药1次,空白组、假手术组、模型组给予蒸馏水。7天后禁食进行造模,空白组不做处理,假手术组只进行穿线,不予结扎。其余各组行左冠状动脉前降支结扎30min,再灌注120min,制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型。造模成功取心脏组织。3.监测并记录缺血/再灌注过程中心电图、血流动力学的改变,分析舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心功能的影响。4.通过HE染色和透射电镜观察MI/RI大鼠心肌组织及超微结构,分析舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心肌组织及超微结构的干预效果。5.分别采用qRT-PCR法、Western blot法、IHC法检测中药舒心生脉丹对SIRT1信号通路相关因子SIRT1、p53、ac-p53、Bax、Bcl-2、Capase-3、Capase-9的mRNA及蛋白的表达量影响。分析舒心生脉丹对MI/RI大鼠心肌组织SIRT1/p53信号通路上相关因子的调控。结果:1.心电图:各组大鼠在造模成功后心电图均有明显ST段改变,肢体导联出现ST段抬高,并有出现T波倒置改变;再灌注30min后各组大鼠心电图提示ST段不同程度回落改变,提示MI/RI大鼠造模成功。2.血流动力学:与模型组相比,舒心生脉丹各剂量治疗组及阳性对照组大鼠血流动力学指标均有不同程度的改善,舒心生脉丹组改善更为明显。3.HE染色:MI/RI模型组大鼠心肌组织结构欠完整,形态排列紊乱,细胞间质水肿明显,细胞核出现固缩。与模型组相比,中药舒心生脉丹各治疗组结构相对完整,形态排列较规则,层次较清晰,细胞间质水肿程度较模型组减轻,细胞核固缩减少。其中舒心生脉丹高剂量组改善最明显。4.电镜观察:模型组肌纤维排列不整齐,线粒体肿胀,排列呈不规则形态,部分线粒体嵴不完整,出现空泡。中药舒心生脉丹各剂量治疗组及阳性药组线粒体可见轻度肿胀变形,多数结构完整,肌纤维排列大致整齐,程度较模型组减轻。5.qRT-PCR法检测MI/RI大鼠心肌组织中SIRT1、Bcl-2、Bax、Caspase-9的基因表达量:与模型组相比,舒心生脉丹能上调SIRT1、Bcl-2的基因表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）,降低Bax、Caspase-9基因表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）。Western blot法检测MI/RI大鼠心肌组织中SIRT1、Caspase-9、p53、ac-p53的蛋白表达量:与模型组相比,舒心生脉丹能够上调MI/RI模型大鼠心肌细胞中SIRT1的蛋白表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）,下调Caspase-9、p53、ac-p53的蛋白表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）。IHC检测提示舒心生脉丹能够上调SIRT1的蛋白表达,降低p53、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达。结论:1.舒心生脉丹对能改善大鼠MI/RI后的心功能和心肌超微结构,对心肌细胞具有保护作用。2.舒心生脉丹能调控MI/RI模型大鼠心肌细胞中SIRT1、p53、ac-p53、Bax、Bcl-2、Capase-3、Capase-9的mRNA及蛋白的表达量,减少细胞凋亡的发生,其保护作用与细胞凋亡机制相关。
杨小琪[6]（2020）在《定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究》文中指出目的:通过建立大鼠Langendorff离体心肌缺血再灌注动物模型,研究定心藤活性成分TL（3α-5α-tetrahydrodeoxycordifoline lactam）抗心肌缺血再灌注损伤的药效学研究和相关机制,探讨定心藤活性成分TL对缺血再灌注损伤大鼠心肌的保护作用是否通过线粒体KATP通道和抗氧化途径介导表达而实现的。方法:1.定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤药效研究SD大鼠30只随机分为5组:sham组、I/R组、定心藤活性成分TL高、中、低剂量组（给药剂量分别为14.4、4.8、1.44mg/kg）,每组6只。实验前先给大鼠一周的适应时间,然后给与sham组和I/R组生理盐水腹腔注射,定心藤活性成分TL组给予高中低剂量腹腔注射一周,然后用langendorff离体心脏模型进行心脏灌流,连接生理信号记录分析系统记录各数据,对大鼠离体心脏给与平衡20min,停灌20min,复灌180min处理,观察平衡期、复灌期各组大鼠+dp/dtmax（左心室内最大上升速率）、-dp/dtmax（左心室内最大下降速率）、LVDP（左室发展压）、LVEDP（左室舒张末期压）、冠状动脉血流量的血流动力学指标的变化。在复灌120min时收集心脏流出液,并使用LDH试剂盒测定流出液LDH的浓度。复灌180min后通过TTC对各分组大鼠心脏进行染色并测定梗死面积。2.定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤作用机制研究SD大鼠60只随机分为5组:sham组、I/R组、定心藤中剂量组（给药剂量4.8mg/kg）I/R+TL组、定心藤中剂量组+5-HD组（5-羟基癸酸,一种线粒体KATP通道阻滞剂）I/R+TL+5-HD组、I/R+5-HD组,每组12只。实验前先给大鼠一周的适应时间,然后给与sham组、I/R组和I/R+5-HD组生理盐水腹腔注射,定心藤中剂量组和定心藤中剂量组+5-HD组给予定心藤活性成分TL腹腔注射一周,然后用langendorff离体心脏模型进行心脏灌流,连接生理信号记录分析系统记录各数据,对大鼠离体心脏给与平衡20 min,停灌20 min,复灌180 min处理,对于I/R+TL+5-HD组和TL+5-HD组在停灌前10 min给予10分钟的5-HD预处理。Western Blot方法检测心脏组织中Bax、Bcl-2、HO-1、细胞色素C（cytochrome C,CYTC）、Caspase-3、MN-SOD、Catalase蛋白的表达水平。采用MTS法利用试剂盒测定心脏组织Caspase 3和Caspase 9的酶活性。结果:1.定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤药效研究Langendorff离体心脏缺血再灌注损伤实验中,血流动力学结果显示,定心藤活性成分TL的高中剂量组可提高缺血再灌注末期的+dp/dt、-dp/dt、LVDP、LVEDP和冠脉血流量水平,但在定心藤中剂量组时效果更好。复灌后120 min流出物通过LDH试剂盒检测,结果显示定心藤中剂量组可减少LDH的水平;TTC染色结果显示定心藤中剂量组可以明显减少大鼠的心肌梗死面积。2.定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤作用机制研究由于定心藤活性成分TL抗心肌缺血再灌注损伤药效学显示定心藤中剂量组的药效最为显着,因此选择中剂量组进行后续实验机制研究。流动力学结果显示,5-HD预处理10分钟阻止定心藤活性成分TL改善缺血再灌注末期的+dp/dt、-dp/dt、LVDP、LVEDP和冠脉血流量水平;复灌后120 min流出物通过LDH试剂盒检测,结果显示定心藤活性成分TL组缺血后LDH水平明显低于I/R组。用5-HD预处理10分钟阻止定心藤活性成分TL改善缺血再灌注末期LDH活性;单独的5-HD未显示和I/R组心脏功能的任何变化。定心藤活性成分TL显着减少了再灌注损伤引起的梗塞面积,5-HD完全阻断了这种效应。Western Blot结果显示I/R导致MN-SOD、Catalase、HO-1蛋白水平降低,Bax、Cytochrome C和Caspase-3蛋白水平的增加,以及Bcl-2水平的降低,其被定心藤活性成分TL处理逆转,5-HD减弱了定心藤活性成分TL的作用,5-HD本身对这些蛋白水平无显着影响。结论:定心藤活性成分TL对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,且该作用是与线粒体KATP通道和抗氧化途径介导表达有关。
彭科[7]（2020）在《右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究》文中提出第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤目的:探讨右美托咪定（dexmedetomidine,DEX）后处理对原代乳鼠心肌细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）过程中心肌细胞损伤的影响。方法:（1）新生乳鼠原代心肌细胞的提取和培养。选取新生48小时内的Sprague Dawley（SD）大鼠提取和原代培养心肌细胞,并运用免疫荧光染色法鉴定心肌细胞的纯度。（2）不同浓度的右美托咪定对正常培养的原代心肌细胞的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组,0.1、1、10、50μM不同浓度的右美托咪定处理24小时组。与对照组相比,观察不同浓度的右美托咪定对正常状态下培养的心肌细胞是否存在细胞毒性。（3）不同缺氧复氧时间对原代心肌细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为7组（每组n=6）:对照组和6个H/R组。H/R组通过氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）建立细胞 H/R 模型,分别于缺氧 3、6、12 小时+复氧3小时（H3R3、H6R3、H12R3组）以及缺氧6小时+复氧6、12、24小时（H6R6、H6R12、H6R24组）的不同缺氧复氧时间点使用cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒检测心肌细胞活力,确定本实验条件下细胞缺氧复氧模型的作用时间点。（4）不同浓度右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤后细胞活力和细胞毒性的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组,3个右美托咪定处理组。处理组中分别给予0.1、1、10μM不同浓度的右美托咪定后处理（即在复氧开始时加入到细胞培养基）,使用CCK-8和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测心肌细胞活力和细胞毒性,以确定本实验中最佳的右美托咪定后处理浓度。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时细胞凋亡的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。在复氧开始时给予1 μM的右美托咪定后处理,复氧结束后采用Annexin V-FITC/PI双染法和流式细胞技术检测心肌细胞的凋亡率。（6）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α）、凋亡相关基因 B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）和BCL2样蛋白X（BCL2-Associated X,BAX）蛋白表达水平影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用Western Blot检测各组HIF-1α、BCL-2、BAX蛋白水平的表达。（7）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和BAX在细胞内的定位的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用双标免疫荧光法检测各组心肌细胞内HIF-1α和BAX蛋白在细胞中的定位情况和表达水平。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）乳鼠原代心肌细胞正常培养至72小时,经免疫荧光染色鉴定其心肌细胞纯度达98%,可稳定供以下实验使用。（2）0.1、1、1 0 μM的右美托咪定对于正常培养的心肌细胞活力均无显着影响,而高浓度的右美托咪定（50μM）则使得细胞活力降低至对照组的82.42±2.39%（P<0.01）,说明右美托咪定大于50μM的浓度时会对原代心肌细胞产生一定的细胞毒性。（3）心肌细胞的活力在H3R3、H6R3、H12R3、H6R6、H6R12、H6R24的各个不同时间点和对照组细胞相比均明显下降（P<0.01）,选取缺氧6小时复氧3小时用于后续的细胞实验（此时细胞活力下降至对照组的63.21±1.74%）。（4）与H/R组相比,使用0.1、1、10μM的右美托咪定后处理显着改善H/R损伤后的心肌细胞活力,减少LDH释放量（P<0.01）。其中浓度为1 μM的右美托咪定后处理效果最好,细胞活力与H/R组相比为75.21±2.23%vs.60.00±1.11%（P<0.01）,培养基中 LDH 释放量与 H/R 组相比为 200.8±7.37%vs.267.5 ± 5.57%（P<0.01）。因此,选取1μM的右美托咪定用于后续的细胞实验。（5）流式细胞凋亡率检测结果显示,与对照组相比,缺氧复氧过程显着增高原代心肌细胞的凋亡率至38.60±0.90%（P<0.01）,而使用1 μM右美托咪定后处理可以使H/R损伤后的心肌细胞凋亡率降低至20.94±0.96%（P<0.01）。（6）Western Blot结果显示,H/R组细胞HIF-1α和BAX的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）,而BCL-2蛋白表达和BCL-2/BAX的比值显着降低（P<0.01）。右美托咪定后处理显着降低了 HIF-1α和BAX蛋白的表达水平（P<0.01）,并且翻转了 BCL-2蛋白表达（P<0.05）以及BCL-2/BAX的比值（P<0.01）。（7）双标免疫荧光实验结果显示,HIF-1α与BAX蛋白的表达在原代心肌细胞内存在共定位关系。在H/R组中,HIF-1α和BAX的荧光表达强度较对照组显着升高（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低了H/R损伤时HIF-1α和BAX的荧光表达水平（P<0.01）。结论:1 μM右美托咪定后处理可以显着减轻乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧损伤,具体表现为改善H/R损伤导致的细胞活力下降、减轻细胞毒性、抑制LDH释放量、以及降低细胞凋亡率。右美托咪定后处理在细胞水平上减轻缺氧复氧损伤的保护作用很可能与其抑制HIF-1α蛋白的表达,调节凋亡相关蛋白的水平,从而抑制H/R损伤导致的心肌细胞凋亡有关。第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制目的:进一步探讨右美托咪定后处理是否通过调控HIF-1α的转录活性、抑制细胞凋亡、从而减轻缺氧复氧导致的心肌细胞损伤及其分子机制。方法:（1）HIF-1α 脯氨酰羟化酶 2（prolyl hydroxylase-2,PHD2）抑制剂 IOX2 对原代心肌细胞常氧和H/R状态下HIF-Iα和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+IOX2组。IOX2是一种特异性的HIF-1α PHD2抑制剂,可通过抑制HIF-1α的降解从而增强其转录活性。IOX2的使用浓度为50μM,在复氧开始时使用右美托咪定前加入到细胞培养基之中。使用Western Blot方法检测HIF-1α、Bcl-2/adenovirus E1B 19kDa相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19kD interacting protein 3,BNIP3）、半胱氨酸蛋白酶-3 剪切体（cleaved caspase-3）蛋白水平的表达。（2）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为0.1%的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）,用于溶解IOX2。使用CCK-8试剂盒检测各组心肌细胞的活力。（3）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时线粒体膜电位的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。使用JC-1荧光染色法检测各组心肌细胞线粒体膜电位（ΔΨm）水平。正常线粒体膜中,JC-1以聚合体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出红色荧光;而凋亡细胞的线粒体膜电位ΔΨm下降或消失,JC-1以单体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出绿色荧光。通过分析不同状态下JC-1红色/绿色荧光的比值可以得到细胞线粒体膜电位的相对数值,线粒体膜电位下降提示线粒体的结构性损伤。（4）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot 检测各组细胞 HIF-1α和 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、聚 ADP-核糖聚合酶 1 剪切体（cleaved poly ADP-ribose polymerase 1,cleaved PARP-1）蛋白水平的表达。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX 组。使用荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测各组细胞内HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平。（6）通过质粒转染正常培养的原代心肌细胞以证实HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。合成目的基因 HIF-1α DNA,将其构建到质粒载体 pLenti-GⅢ-CMV-GFP-2A-Puro上:并合成启动子BNIP3 promoter和BNIP3启动子突变体,将其构建到双荧光酶素报告质粒载体 pLenti-miniCMV-RenLuc-PGK-Luc-SV40-GFP-2A-Puro 上。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:BNIP3启动子组、BNIP3启动子+空载质粒组、BNIP3启动子+HIF-1α质粒组、BNIP3启动子突变+HIF-1α质粒组。将质粒转染正常培养的心肌细胞24小时后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达强度,并使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测转录因子HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。（7）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时BNIP3启动子活性的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+DEX组、H/R组、H/R+DEX 组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。将报告基因 BNIP3 promoter质粒分别转染以上细胞24小时之后,按照分组情况对细胞进行H/R、DEX、IOX2的处理。使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测BNIP3启动子的活性。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,IOX2使正常培养的原代心肌细胞HIF-1α蛋白表达水平明显着升高为对照组的254.4±22.37%（P<0.01）。在H/R状态下,IOX2仍有进一步升高HIF-1α的趋势,但差异不具有统计学意义（431.1±37.86%vs.353.2±35.61%,P>0.05）。同时,IOX2并不影响BNIP3和cleaved caspase-3在正常培养的细胞和H/R状态下细胞中的表达。该结果说明IOX2可以有效的稳定HIF-1α的表达水平而并不增加细胞凋亡。（2）IOX2对于正常培养的心肌细胞活力没有明显影响。H/R造成细胞活力显着下降至对照组的60.26 ± 2.17%（P<0.01）,使用1 μM的右美托咪定后处理使细胞活力升高为77.72±1.63%（P<0.01）,而IOX2使用后细胞活力又下降为63.10±2.36%（P<0.01）。因此,IOX2逆转了右美托咪定后处理的作用,说明右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致的心肌细胞活力下降。（3）线粒体膜电位JC-1染色结果显示,H/R使原代心肌细胞的线粒体膜电位ΔΨm显着下降,即较高的绿色JC-1单体/红色JC-1聚合体比值。1μM的右美托咪定后处理减轻了线粒体膜电位ΔΨm的下降,使得红色JC-1聚合体增加,绿色JC-1单体减少。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对线粒体膜电位ΔΨm的效果（P<0.01）。这提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡过程中线粒体结构损伤。（4）Western Blot结果显示,1 μM的右美托咪定后处理使H/R时原代心肌细胞的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,而BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡相关蛋白的改变。（5）qPCR结果显示,H/R时HIF-1α和BNIP3的mRNA表达水平显着升高（P<0.01）。1μM的右美托咪定后处理显着降低了 H/R时的BNIP3的激活（P<0.01）,但并没有明显改变HIF-1α的mRNA表达水平。该结果提示右美托咪定后处理在HIF-1α的转录后水平而非mRNA水平抑制了 HIF-1α蛋白对靶基因BNIP3的激活。（6）正常培养的心肌细胞转染BNIP3启动子/启动子突变体、HIF-1α质粒24小时后,双荧光酶素报告基因结果显示BNIP3启动子+HIF-1α质粒组的荧光素酶活性显着升高（P<0.01）,BNIP3启动子突变+HIF-1α DNA质粒组的荧光素酶活性与之相比则显着降低（P<0.01）。该结果说明合成的BNIP3启动子可以被HIF-1α DNA激活,该质粒系统的构建有效。（7）双荧光酶素报告基因结果显示,H/R时荧光素酶活性显着升高、BNIP3启动子被激活（P<0.01）,1 μM的右美托咪定后处理则降低了 H/R引起的高荧光素酶活性（P<0.01）。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对BNIP3启动子活性的抑制作用（P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α的转录活性抑制了 H/R导致的BNIP3启动子的激活。结论:特异性HIF-1α脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2可以稳定HIF-1α蛋白的表达水平,同时对乳鼠原代心肌细胞的活性和细胞凋亡没有不良影响。1 μM的右美托咪定后处理可以改善H/R后原代心肌细胞的活力、恢复线粒体膜电位、减轻线粒体结构损伤、调控凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平、并在转录后水平抑制了 HIF-1α对靶基因BNIP3的激活。然而,IOX2逆转了上述效果,阻断了右美托咪定后处理对原代心肌细胞缺氧复氧的保护作用。综合本部分机制研究的结果,右美托咪定后处理通过在转录后水平作用于HIF-1α此关键靶点,抑制其对下游靶基因的激活,抑制凋亡级联反应,减少细胞凋亡,从而在细胞水平减轻原代心肌细胞缺氧复氧损伤。第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤目的:阐明右美托咪定后处理对大鼠心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）过程中心肌损伤和凋亡相关蛋白表达的影响,并进一步证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号通路发挥对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用。方法:（1）大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-lα蛋白表达随再灌注时间的变化。取24只健康成年雄性SD大鼠随机分为4组（每组n=6）:假手术组、心肌缺血30分钟再灌注2小时、6小时、和24小时组。使用Western Blot检测再灌注2、6、24小时大鼠左心室组织中HIF-1α的蛋白表达水平,取其表达变化最显着的时刻作为后续实验的观察时间点。（2）右美托咪定后处理和IOX2对心肌缺血再灌注过程中大鼠心率的影响。使用MedLab生物医学信号处理系统监测大鼠心电图的变化。取42只健康成年雄性SD大鼠随机分为7组（每组n=6）:假手术组、假手术+DEX组、I/R组、I/R+IOX2组、I/R+DEX组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为5%二甲基亚砜（DMSO）+30%聚乙二醇300（PEG300）,用于溶解IOX2。再灌注开始时,经过右颈内静脉泵注右美托咪定负荷剂量6 μg/kg/h持续10分钟,追加维持剂量0.7μg/kg/h持续15分钟。IOX2组中,使用右美托咪定前经大鼠腹腔给予25μg/mg的IOX2。记录基础值、缺血15和30分钟、再灌注15、30、60分钟的心率值,并比较心率随时间变化的曲线下面积以观察心率在此期间整体的变化。（3）右美托咪定后处理和IOX2对大鼠心肌缺血再灌注过程中动脉血气、电解质、酸碱平衡的影响。上述7组大鼠于再灌注6小时经腹主动脉取血,行动脉血pH、动脉血氧分压（partial pressures of oxygen,PaO2）、动脉血二氧化碳分压（partial pressures of carbon dioxide,PaCO2）、动脉氧饱和度（arterial oxygen saturation,SaO2）、血红蛋白（hemoglobin,Hb）、红细胞压积（hematocrit,Hct）、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、碱剩余（base excess,BE）的分析,以了解各组动物在实验过程中内环境的是否稳定。（4）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组 n=6）:假手术组、假手术+DEX 组、I/R 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。给药方式同第（2）部分。于再灌注6小时取下腔静脉血,使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测血清cTnI的水平,以明确各组大鼠心肌损伤的程度。（5）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌组织凋亡的影响。上述6组大鼠于再灌注6小时取左心室组织,行冰冻切片。并使用原位末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）标记凋亡细胞断裂基因组 DNA的3’-OH末端,在荧光显微镜下检测各组大鼠心肌绀织的凋亡情况。（6）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌梗死面积的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。于再灌注 6小时,左心室组织行2%伊文氏蓝/1%氯化二苯四氮唑（Evans blue/2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色,分析心肌组织缺血危险区（area at risk,AAR）和心肌梗死区（infarct area,IA）的面积,心肌切片后以称重法分别记录其重量,心肌梗死面积最终以IA 区的承量占AAR区的市量的百分比（IA总重量/AAR总重量×100%）来表示。（7）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。取36只雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot检测缺血再灌注、右美托咪定、IOX2干预后各组大鼠心肌组织中HIF-1α和凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平的变化。（8）心肌缺血再灌注实验过程中各组大鼠死亡率的比较。记录和比较以上所有7部分实验中,在未达到实验终点前由于任何原因引起的的大鼠死亡情况。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,缺血30分钟再灌注2、6、24小时的三组大鼠心肌组织内HIF-1α蛋白表达均较假手术组显着升高（P<0.01）,且再灌注6小时组的表达量显着高于2小时组（P<0.01）和24小时组（P<0.05）。因此,选取缺血30分钟再灌注6小时作为最佳时间点应用于后续大鼠实验。（2）心电图及心率监测结果显示,心肌缺血再灌注过程引起了大鼠心电图的显着变化,即缺血时ST段显着抬高、再灌注时出现快速型心律失常如室性心动过速、甚至室颤。右美托咪定后处理对于ST段变化和心律失常没有显着影响。实验过程中右美托咪定组的大鼠心率有减慢的趋势,但组内和组间比较的差异都不具有统计学意义（P>0.05）,各组的曲线下面积（心率×时间）也相似。（3）血气、电解质、血红蛋白的结果显示,再灌注6小时各组大鼠的动脉血pH、Pa02、PaCO2、SaO2、Hb、Hct、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、BE 数值都在正常范围。与假手术组相比,经受心肌I/R的大鼠PaCO2、HCO3-、BE的数值偏低,但组间比较差异不具有统计学意义（P>0.05）。因此,实验过程中大鼠的内环境保持稳定。（4）血清cTnI检测结果显示,I/R组大鼠血清cTnI浓度显着升高为9.78±0.42 ng/ml（P<0.01）,右美托咪定后处理则使cTnI降低至5.07±0.33 ng/ml（P<0.01）,但I/R+DEX+IOX2组又升高为8.19±0.43 ng/ml（P<0.01）。右美托咪定后处理显着减少了大鼠心肌I/R导致的cTnI释放,该保护作用被IOX2逆转,提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌组织损伤。（5）TUNEL凋亡检测结果显示,I/R组大鼠心肌组织凋亡率为36.67±1.97%（P<0.01）,右美托咪定后处理组则降低至15.59±0.80%（P<0.01）,而I/R+DEX+IOX2组又升高为28.74±1.38%（P<0.01）。此结果证明右美托咪定后处理通过调控HIF-1 α减轻I/R导致大鼠心肌组织的凋亡。（6）Evans Blue/TTC双染检测结果显示,除假手术组外的各组大鼠心肌缺血危险区AAR的面积在45%左右,组间具有可比性（P>0.05）。I/R组和I/R+IOX2组大鼠的心肌梗死面积显着升高为39.27±0.72%和41.53±1.50%（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低梗死面积至20.20±2.07%（P<0.01）,而IOX2又使梗死面积增加至33.90±2.06%（P<0.01）。因此,右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌梗死面积。（7）Western Blot的结果显示,右美托咪定后处理使I/R时心肌组织的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,而IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α蛋白减轻I/R导致大鼠心肌凋亡相关蛋白的改变。（8）整个实验过程中总共有9只大鼠在实验终点前死亡。死亡原因包括失血、严重心律失常（室性心动过速和室颤）、呼吸衰竭。死亡率分别为:假手术组（1/25,即4.0%）、假手术+DEX组（0/6,即0%）、I/R组（2/38,即5.26%）、I/1R+IOX2组（2/20,即 10%）、I/R+DEX 组（1/1 9,即 5.26%）、I/R+DEX+IOX2 组（2/20,即10%）、I/R+DEX+溶剂组（1/19,即5.26%）。各组死亡率的组间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论:右美托咪定后处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,表现为降低血清cTnl水平、减轻心肌组织凋亡、减少心肌梗死面积、调控凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平。特异性 HIF-1α 脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2则逆转了右美托咪定后处理的心肌保护作用和以上指标的变化。综合本部分研究结果,右美托咪定后处理通过作用于HIF-1α此关键靶点减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。
宁小伟[8]（2020）在《蒙药当贡-3通过PI3K/Akt信号通路干预心肌缺血再灌注损伤大鼠的机制研究》文中研究表明目的通过复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,探讨蒙药当贡-3对大鼠缺血再灌注心肌的影响及其对缺血再灌注心肌的保护作用与PI3K/Akt信号通路的关系。方法将SD大鼠随机分为7组,分别为:空白组（A组）,模型组（B组）,假手术组（C组）,当贡-3高剂量组（D组）、中剂量组（E组）、低剂量组（F组）,当贡-3高剂量+PI3K/Akt阻断剂LY294002组（G组）,每组10只,共70只。D、E、F和G组分别给予当贡-3 1.08g/kg、0.54g/kg、0.27g/kg、1.08g/kg的混悬液灌胃,A、B及C组则灌胃等量蒸馏水,每天1次,共21天;灌胃结束后造模,其中G组大鼠于造模前10min尾静脉注射LY294002（0.3mg/kg）。实验结束后取材,Elisa法检测大鼠血清LDH、CK-MB活性;Evans Blue+TTC双染法测定大鼠心肌梗死面积;TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡指数;HE染色观察心肌组织病理形态学变化;Western blot测定心肌组织PI3K、Akt、Bax、Bcl-2蛋白水平。结果1.大鼠血清LDH、CK-MB含量变化:C组大鼠血清LDH、CK-MB含量与A组比无明显变化（P>0.05）。B组大鼠血清LDH、CK-MB含量显着高于C组（P<0.01）。当贡-3干预后,D、E、F组大鼠血清LDH、CK-MB含量明显低于B组（P<0.01）。D组大鼠血清LDH、CK-MB含量显着低于E、F组（P<0.01）。G组大鼠血清LDH、CKMB含量显着高于D组（P<0.01）。2.大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数测定:C组大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数与A组比无明显变化（P>0.05）。B组大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数显着高于C组（P<0.01）。当贡-3干预后,D、E、F组大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数明显低于B组（P<0.01）。D组大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数显着低于E、F组（P<0.01）。G组大鼠心肌梗死面积、细胞凋亡指数明显高于D组（P<0.01）。3.大鼠心肌组织HE染色结果:A、C组大鼠心肌组织无明显病理改变。B组心肌组织出现断层、纹理模糊、心肌纤维形态不规则、间质内大量炎细胞浸润等病理表现。当贡-3干预后,D、E、F组心肌组织病理形态与B组相比具有不同程度的改善,尤以D组改善明显。4.大鼠心肌组织PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达变化:C组大鼠心肌组织PI3K、Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达与A组比无明显变化（P>0.05）。与C组比,B组大鼠心肌组织PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达明显下降,Bax蛋白表达明显升高（P<0.01）。当贡-3干预后,与B组比,D、E、F组PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达明显上升,Bax蛋白表达明显下降（P<0.01）。与E、F组比,D组PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达明显上升,Bax蛋白表达明显下降（P<0.01）。与D组比,G组PI3K、Akt、Bcl-2蛋白表达明显下降,Bax表达显着升高（P<0.01）。结论蒙药当贡-3在心肌缺血再灌注时具有保护心肌的作用,其发生机制可能与抑制心肌细胞凋亡,活化PI3K/Akt信号通路有关。
杨潇[9]（2020）在《蒙药当贡-3对大鼠缺氧-复氧心肌细胞活性影响的研究》文中进行了进一步梳理目的探讨蒙药当贡-3（DG-3）对大鼠缺氧/复氧（Hypoxia/Reoxygenation,H/R）心肌细胞活性影响的研究。方法将DG-3复方药物进行提取得药物总提物,体外培养H9c2心肌细胞,给予细胞DG-3药物干预,以复方丹参滴丸（FF）为阳性对照组,选用Co Cl2溶液为缺氧剂,噻唑蓝（MTT）检测细胞存活率,验证药物的毒性作用及筛选药物浓度,优化H/R条件,在体外模拟心肌缺血-再灌注损伤（Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury,MIRI）模型。将心肌细胞随机分为6组:空白对照组（control）、缺氧/复氧损伤组（H/R）、DG-3低、中、高剂量组（H/R+低、中、高相应浓度剂量的DG-3）、FF剂量组（H/R+相应浓度剂量的FF）,通过MTT法检测细胞存活率,试剂盒检测细胞匀浆液中过氧化氢酶（Catalase,CAT）的水平、细胞上清液中乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase,LDH）以及肌酸激酶（Creatine Kinase,CK）的释放量,实时-荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative,Rt-q PCR）检测Bax、Bcl-2、caspase-3 m RNA的水平。结果1.MTT结果得出,DG-3药物浓度在0.05-0.4mg/m L范围内,细胞存活率无明显改变,组间无统计学意义（P>0.05）,DG-3药物浓度在0.8-6.4mg/m L内,细胞存活率降低（P<0.05）,筛选DG-3低、中、高药物浓度分别为0.1、0.2、0.4mg/m L。2.依据心肌细胞的存活率,确定H/R模型的最佳条件为Co Cl2的浓度为1000mmol/L,缺氧时间21 h,复氧时间2 h。3.与control对比,H/R细胞存活率下降（P<0.05）,细胞匀浆中的CAT水平降低（P<0.05）,细胞上清液中LDH及CK的释放量升高（P<0.05）,Bax、caspase-3的m RNA水平升高（P<0.05）,Bcl-2的m RNA水平降低（P<0.05）。与H/R对比,DG-3中、高剂量组能够升高细胞存活率（P<0.05）、降低细胞上清液中LDH及CK释放量（P<0.05）、升高细胞匀浆中CAT的活性（P<0.05）,低、中、高剂量组能够降低Bax、caspase-3的m RNA表达水平（P<0.05）、升高Bcl-2的m RNA表达水平（P<0.05）,并且作用可以呈现出浓度依赖性。结论DG-3总提取物能够抑制由Co Cl2诱导的H/R而出现的心肌细胞凋亡,其保护机制可能与DG-3能够降低Bax、caspase-3的m RNA水平,升高Bcl-2的m RNA水平有关。
张晓锋[10]（2020）在《KP-4对缺血再灌注损伤的心肌保护作用及其机制研究》文中研究说明研究背景缺血性心脏病（Ischemic heart disease,IHD）是全球最常见的死亡原因之一,其目前最有效的治疗策略是迅速恢复心脏中缺血部位的血液供应（也称为再灌注治疗）。然而,再灌注本身也可引起进一步的心肌损伤,即心肌缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury,IRI）。IRI的病理过程复杂,其病理机制尚未彻底阐明。研究认为氧化应激、钙离子超载、生理p H值的快速恢复、线粒体通透性转换孔（Mitochondrial permeability transition pore,m PTP）的开放、代谢紊乱和炎症反应为其主要病理介导因素。其中,再灌注期产生大量的活性氧（Reactive oxygen species,ROS）导致前氧化系统和抗氧化系统平衡紊乱,大量的ROS引起细胞损伤,导致心肌细胞坏死和凋亡的现象称为氧化应激。氧化应激被认为是心肌缺血再灌注损伤的主要原因。抑制心肌细胞氧化应激及氧化应激导致的心肌细胞凋亡和坏死是临床干预缺血再灌注损伤的重要策略,对缺血类心脏疾病病人的预后具有重要意义。心肌缺血再灌注损伤严重降低了再灌注治疗的益处,影响患者的治疗。目前基础研究和临床研究中用于缓解心肌缺血再灌注损伤的干预措施主要包括:缺血预适应、缺血后适应、远程缺血调节和药物干预。以上措施虽然能够一定程度上缓解心肌缺血再灌注损伤,然而,大部分研究还局限在基础实验阶段,而且在临床应用过程中都存在一定的局限性,其临床效果还有待进一步验证。大量研究表明,缺血预适应和后适应等治疗手段对心肌的保护作用与激活再灌注损伤补救激酶（Reperfusion injury salvage kinase,RISK）信号通路相关。RISK信号通路主要包括ERK1/2途径和PI3K/Akt途径。PI3K/Akt和ERK1/2两条信号通路的激活可以调控其下游靶标糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）的活性,同时促进己糖激酶-II（Hexokinase-II,HK-II）与线粒体的结合,并调控Bcl-2家族等线粒体相关的蛋白,最终抑制线粒体的结构和功能的损坏,对缺血再灌注损伤的心肌有保护作用。RISK信号通路是抑制缺血再灌注损伤最重要的靶标之一。异甜菊醇是甜菊醇的对映体,是由贝壳杉烷类化合物甜菊醇苷中化学提取的一种单体。异甜菊醇钠（Isosteviol sodium,STVNa or KP-4）是异甜菊醇的钠盐形式。研究表明,异甜菊醇具有抑制豚鼠和大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用。然而,KP-4在缺血再灌注中的心肌保护作用及其潜在作用机制尚不完全清楚,需要进一步研究。目的探究KP-4抑制心肌缺血再灌注损伤的作用及其机制。本课题组前期研究表明,KP-4能够抑制心肌细胞的线粒体损伤。因此,本研究试图探索其是否通过Akt/GSK-3β信号通路和HK-II途径来抑制线粒体损伤,从而缓解心肌细胞氧化应激损伤,起到对心肌的保护作用的。方法（1）采用Langendorff离体心脏灌流系统,通过结扎左前降支冠状动脉的方法构建大鼠急性心肌缺血再灌注模型,停灌-复灌的方法构建大鼠离体心脏停跳-再灌注模型。（2）以Powerlab系统连续记录不同时间点的血流动力学指标,对结果分析后用心率（Heart rate,HR）、左室内压最大上升速率(Maximal rise rate of left ventricularpressure,+dp/dtmax)、左心室发展压（Left ventricular development pressure,LVDP）等指标来评价离体心脏的心功能。采用称重法收集并记录不同时间点的冠脉流量（Coronary flow,CF）。采用生化分析仪测定停跳-再灌注灌流液中的肌酸激酶同工酶（Creatine kinase isoenzyme,CK-MB）、心肌肌钙蛋白T（Cardiac troponin T,c Tn T）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）浓度。（3）采用过氧化氢（H2O2）构建H9c2心肌细胞氧化应激模型。通过对细胞活力、LDH释放、细胞的凋亡和坏死水平以及细胞核形态的检测,评价KP-4抗氧化应激损伤的作用。通过检测细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）活性和丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量来评价KP-4的抗氧化能力。（4）采用Western Blot检测Bcl-2/Bax,p-S473 Akt/Akt,p-GSK-3β/GSK-3β和HK-II的变化情况,探究KP-4预处理抑制H9c2氧化应激损伤的可能机制。通过JC-1染色和激光共聚焦显微镜,检测线粒体膜电位水平。结果（1）KP-4能够改善缺血再灌注后心脏的血流动力学参数(CF,+dp/dtmax和LVDP),并且能够降低停跳-再灌注后灌注液中的心肌酶（CK-MB、c Tn T和LDH）浓度。（2）KP-4预处理能够抑制H2O2诱导的H9c2心肌细胞活力的降低和LDH的释放,维持细胞和细胞核正常的形态,同时使细胞的凋亡和坏死水平降低。此外,KP-4能够降低氧化应激时H9c2细胞内的ROS水平和MDA浓度,同时提高SOD活性。（3）KP-4预处理上调了H9c2心肌细胞Akt和GSK-3β的磷酸化水平,并促进了HK-II与线粒体的结合,同时提高线粒体膜电位和Bcl-2/Bax的水平。（4）LY290004（PI3K抑制剂,特异性的抑制Akt信号通路的信号传导）抑制Akt的磷酸化则消除了KP-4的这种作用,使细胞活力和GSK-3β磷酸化水平降低。结论:（1）KP-4能够改善离体大鼠心肌缺血再灌注的心功能。（2）KP-4抑制心肌缺血再灌注损伤的作用可能与其抑制心肌细胞氧化应激损伤有关。KP-4可以有效抑制H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激损伤,而Akt/GSK-3β信号通路和HK-II途径参与了KP-4对心肌细胞的保护作用。
二、大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡情况及缺血预处理对其影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡情况及缺血预处理对其影响（论文提纲范文）
（1）电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌损伤标志物、凋亡指数和形态学的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞焦亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞自噬的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 电针预处理对心肌缺血再灌注模型大鼠FXR/SHP通路的调控作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录一 文献综述 心肌缺血再灌注损伤相关信号通路研究进展 |
| 参考文献 |
| 附图二 |
| 附录三 读博期间发表论文、科研情况 |
| 致谢 |
（2）益气活血中药调节线粒体自噬改善心肌细胞缺氧复氧损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 心肌缺血再灌注损伤研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 线粒体自噬在心肌缺血再灌注损伤中作用及中医药防治研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验一 益气活血中药对H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 益气活血中药通过HIF-1a/BNIP3线粒体自噬通路干预心肌细胞缺氧/复氧损伤 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）OGT介导的RIPK3 O-GlcNAc糖基化在七氟醚后处理抑制心肌缺血再灌注损伤时程序性坏死中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一部分 七氟醚后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.主要仪器和设备 |
| 3.主要试剂及其配置 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要试剂配制 |
| 三、实验方法 |
| 1.在体心肌缺血再灌注损伤模型 |
| 2.实验分组与处理 |
| 3.心肌梗死范围测定 |
| 4.血清LDH浓度测定 |
| 5.HE染色 |
| 6.统计学处理 |
| 四、实验结果 |
| 1.各组血流动力学 |
| 2.各组心肌梗死范围 |
| 3.各组心功能指标 |
| 4.各组心肌组织病理学 |
| 5.各组血清LDH浓度 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 第二部分 七氟醚后处理对心肌缺血再灌注损伤时程序性坏死和RIPK3O-GlcNAc糖基化的影响 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.主要仪器和设备 |
| 3.主要试剂及其配置 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要试剂配置 |
| 三、实验方法 |
| 1.在体心肌心肌缺血再灌注损伤模型 |
| 2.实验分组与处理 |
| 3.伊文思蓝染色与荧光成像 |
| 4.心肌组织中提取蛋白 |
| 5.BCA法测定蛋白浓度 |
| 6.聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白凝胶电泳与转膜 |
| 7.蛋白质印记抗体标记与显色 |
| 8.心肌细胞的免疫共沉淀反应 |
| 9.统计学处理 |
| 四、实验结果 |
| 1.各组坏死心肌细胞表达水平 |
| 2.各组程序性坏死相关蛋白表达水平 |
| 3.各组总蛋白O-GlcNAc糖基化、OGT和 OGA蛋白表达水平 |
| 4.各组O-GlcNAc、RIPK3和MLKL的相互作用 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 第三部分 OGT介导的RIPK3 O-GlcNAc糖基化及其调控的程序性坏死在七氟醚后处理抑制心肌缺血再灌注损伤中的作用 |
| 一、前言 |
| 二、材料与方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.主要仪器和设备 |
| 3.主要试剂及其配置 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要试剂配置 |
| 三、实验方法 |
| 1.离体Langendorff心肌缺血再灌注损伤模型 |
| 2.实验分组与处理 |
| 3.心肌梗死范围测定 |
| 4.冠脉漏出液LDH浓度 |
| 5.心肌组织中提取蛋白 |
| 6.BCA法测定蛋白浓度 |
| 7.聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)蛋白凝胶电泳与转膜 |
| 8.蛋白质印记抗体标记与显色 |
| 9.统计学处理 |
| 四、实验结果 |
| 1.各组血流动力学 |
| 2.各组心肌梗死范围 |
| 3.各组冠脉漏出液LDH浓度 |
| 4.各组总蛋白O-GlcNAc糖基化、OGT和 OGA蛋白表达水平 |
| 5.各组程序性坏死相关蛋白表达水平 |
| 五、讨论 |
| 六、结论 |
| 不足之处与创新点 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 程序性坏死在心血管疾病中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
（4）基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.中医学对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的认识 |
| 1.1 MIRI的中医学病名与病因病机 |
| 1.2 针灸“治未病”理论与“心痛” |
| 1.3 MIRI的中医证治概要 |
| 2.现代医学对MIRI的认识 |
| 2.1 流行病学 |
| 2.2 MIRI概述 |
| 2.3 MIRI的发病因素 |
| 2.4 MIRI的发生机制 |
| 3.MIRI的临床表现和治疗概况 |
| 3.1 MIRI的临床表现 |
| 3.2 西医治疗概况 |
| 3.3 中药治疗概况 |
| 4.针灸“治未病”与MIRI防治的研究现状 |
| 4.1 针灸预处理抗MIRI的用穴与电针刺激参数 |
| 4.2 针灸预处理调控MIRI自噬的研究现状 |
| 5.线粒体自噬在MIRI中的作用 |
| 5.1 线粒体自噬的概述 |
| 5.2 线粒体自噬在MIRI中的研究现状 |
| 5.3 mTORC1-ULK1-FUNDC1信号通路与线粒体自噬 |
| 6.EAP调控mTORC1、ULK1蛋白的研究现状 |
| 第二部分 实验研究 |
| 技术路线图 |
| 实验一 不同电流强度EAP对MIRI的效应差异研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与干预 |
| 2.2 电针预处理操作方法 |
| 2.3 MIRI模型制作与评价 |
| 2.4 室性心律失常评分(VAS) |
| 2.5 心脏Evans blue-TTC染色及心肌IS%、Risk size的计算 |
| 2.6 血清心肌酶谱指标检测 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 不同电流强度EAP对各组大鼠体重及MIRI大鼠术后生存曲线的影响 |
| 3.2 不同电流强度EAP对各组大鼠心律失常、心梗面积比与风险面积比及血清酶谱的影响 |
| 实验二 EAP对MIRI大鼠线粒体自噬的调控效应研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2、实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与干预 |
| 2.2 电针预处理方法 |
| 2.3 MIRI模型制作与评价 |
| 2.4 室性心律失常评分(VAS) |
| 2.5 心脏Evans blue-TTC染色及心肌IS%、Rize size的计算 |
| 2.6 血清心肌酶谱指标检测 |
| 2.7 TUNEL染色 |
| 2.8 自噬小体的检测 |
| 2.9 免疫荧光染色(IF) |
| 2.10 石蜡切片免疫组化染色(IHC) |
| 2.11 mTORC1、ULK1、FUNDC1蛋白检测 |
| 2.12 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 EAP对各组大鼠体重及MIRI术后生存曲线的影响 |
| 3.2 EAP对各组大鼠ECG、VAS、IS%及Risk size的影响 |
| 3.3 EAP可减少MIRI诱导的心肌损伤标志物和细胞凋亡 |
| 3.4 EAP减弱了MIRI诱导的线粒体自噬 |
| 3.5 EAP调节mTORC1,ULK1和FUNDC1的表达 |
| 实验三 EAP减轻MIRI大鼠线粒体自噬的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要实验仪器与耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 实验动物分组与干预 |
| 2.2 电针预处理操作方法 |
| 2.3 MIRI模型制作与评价 |
| 2.4 雷帕霉素的配制 |
| 2.5 室性心律失常评分(VAS) |
| 2.6 心脏Evans blue-TTC染色及心肌IS%、Rize size的计算 |
| 2.7 血清心肌酶谱指标检测 |
| 2.8 TUNEL染色 |
| 2.9 自噬小体的检测 |
| 2.10 免疫荧光染色(IF) |
| 2.11 石蜡切片免疫组化染色(IHC) |
| 2.12 心肌组织线粒体的分离提取 |
| 2.13 mTORC1-ULK1-FUNDC1通路蛋白检测 |
| 2.14 ATP水平的检测 |
| 2.15 统计学处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 雷帕霉素阻断了EAP的心脏保护作用 |
| 3.2 雷帕霉素减弱EAP抑制的线粒体自噬 |
| 3.3 EAP通过mTORC1-ULK1-FUNDC1途径抑制线粒体自噬 |
| 第三部分 讨论 |
| 1.MIRI实验模型的制作与评价 |
| 2.电针预处理PC6的选择依据 |
| 2.1 PC6的现代研究 |
| 2.2 PC6穴名解析 |
| 2.3 PC6的特异性 |
| 2.4 心脏与心包经的联系 |
| 2.5 电针预处理的选择依据 |
| 3.电针预处理刺激强度的选择 |
| 4.MIRI防治与针灸预处理 |
| 5.mTORC1与MIRI线粒体自噬及电针预处理的干预作用 |
| 6.电针预处理减轻MIRI的mTORC1-ULK1-FUNDC1信号机制 |
| 第四部分 结论 |
| 论文创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一: 英文缩略词一览表 |
| 攻读博士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一中西医对心肌缺血再灌注损伤的认识及研究进展 |
| 1 西医对心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 1.1 心肌缺血再灌注损伤的概念及常见损伤 |
| 1.2 心肌缺血再灌注损伤的发病机制 |
| 1.3 西医对心肌缺血再灌注损伤的治疗 |
| 2 中医对心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 2.1 病名源流 |
| 2.2 病因病机 |
| 2.3 辨证分型 |
| 2.4 中医药治疗研究进展 |
| 综述二SIRT1 信号通路在心血管疾病中的研究进展 |
| 实验研究 |
| 第一章 MI/RI大鼠模型的建立及心功能指标测定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验用药 |
| 1.3 实验主要试剂、器械、仪器与耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 MI/RI大鼠模型建立 |
| 2.3 指标检测 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MI/RI大鼠心电图改变 |
| 3.2 MI/RI大鼠血流动力学改变 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心肌组织形态学的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要实验试剂 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 石蜡病理切片的制备 |
| 2.2 HE染色法 |
| 2.3 透射电镜检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HE染色实验结果 |
| 3.2 透射电镜实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心肌组织SIRT1 信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验用药 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 q RT-PCR检测法 |
| 2.2 Western blot检测法 |
| 2.3 IHC检测法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 q RT-PCR实验结果 |
| 3.2 Western blot实验结果 |
| 3.3 IHC 化结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 1 舒心生脉丹的创立和意义 |
| 2 MI/RI模型建立的关键问题 |
| 3 实验指标分析 |
| 3.1 舒心生脉丹对心电图影响 |
| 3.2 舒心生脉丹对血流动力学的影响 |
| 3.3 舒心生脉丹对心肌组织形态学影响 |
| 3.4 对SIRT1 信号通路的影响 |
| 4.实验总结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（6）定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 引言 |
| 一、定心藤活性成分TL抗心肌缺血再灌注损伤药效研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验耗材 |
| 1.4 药品与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 主要溶液的配制 |
| 2.2 定心藤活性成分TL的配制 |
| 2.3 大鼠Langendorff离体心脏再灌注模型建立 |
| 2.4 大鼠离体心脏的制备 |
| 2.5 大鼠离体心脏灌注 |
| 2.6 实验分组与给药 |
| 2.7 观察指标 |
| 2.7.1 心脏血流动力学检测 |
| 2.7.2 心脏流出物乳酸脱氢酶(LDH)活性检测 |
| 2.7.3 心肌梗塞面积测定 |
| 2.8 统计处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 定心藤活性成分TL对心肌缺血再灌注损伤血流动力学影响 |
| 3.2 定心藤活性成分TL对心肌缺血再灌注损伤LDH影响 |
| 3.3 定心藤活性成分TL对心肌缺血再灌注损伤心脏梗死面积影响 |
| 4 小结 |
| 二、定心藤活性成分TL抗心肌缺血再灌注损伤作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 药品与试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 主要溶液的配制 |
| 2.2 大鼠离体心脏灌注 |
| 2.3 实验分组与给药 |
| 2.4 观察指标 |
| 2.4.1 心脏血流动力学检测 |
| 2.4.2 心脏流出物乳酸脱氢酶(LDH)活性检测 |
| 2.4.3 心肌梗塞面积测定 |
| 2.4.4 Caspase 3活性检测试剂盒检测酶活性 |
| 2.4.5 Caspase 9活性检测试剂盒检测酶活性 |
| 2.4.6 Western blot检测 |
| 2.5 统计处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 定心藤活性成分TL基于5-HD对心肌缺血再灌注损伤的血流动力学影响 |
| 3.2 定心藤活性成分TL基于5-HD对心肌缺血再灌注损伤LDH的影响 |
| 3.3 定心藤活性成分TL基于5-HD对心肌缺血再灌注损伤的心脏梗死面积影响 |
| 3.4 定心藤活性成分TL基于5-HD对心肌缺血再灌注损伤的抗氧化指标的影响 |
| 3.5 定心藤活性成分TL基于5-HD对抗心肌缺血再灌注损伤凋亡的影响 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤的作用和机制研究 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
（7）右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 结论和展望 |
| 综述 (第一部分)心肌缺血再灌注损伤和右美托咪定心肌保护作用的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述 (第二部分)A systematic Review: Effects of Perioperative Dexmedetomidine Use on Postoperative Mortality and Major Morbidity in Adult Patients Who undergo Cardiac and Non-cardiac Surgery |
| References |
| 附录 |
| 个人简历及博士研究生期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）蒙药当贡-3通过PI3K/Akt信号通路干预心肌缺血再灌注损伤大鼠的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）蒙药当贡-3对大鼠缺氧-复氧心肌细胞活性影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新点及不足 |
| 参考文献 |
| 文献综述 中医药治疗心肌缺血-再灌注损伤的实验研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略语表 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（10）KP-4对缺血再灌注损伤的心肌保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 心肌缺血再灌注损伤概述 |
| 1.2 心肌缺血再灌注损伤的病理机制和治疗措施研究现状 |
| 1.2.1 心肌缺血再灌注损伤的病理机制 |
| 1.2.2 心肌缺血再灌注损伤的治疗措施研究现状 |
| 1.3 氧化应激与心肌缺血再灌注损伤 |
| 1.3.1 ROS的产生与清除机制 |
| 1.3.2 氧化应激促进心肌缺血再灌注损伤的机制 |
| 1.4 线粒体死亡途径 |
| 1.5 RISK信号通路 |
| 1.5.1 Akt |
| 1.5.2 GSK-3β |
| 1.5.3 HK-II |
| 1.6 KP-4的相关研究进展 |
| 1.7 本课题的研究意义和研究内容 |
| 1.7.1 研究意义 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第二章 KP-4抗离体心肌缺血再灌注损伤的心脏保护作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验仪器设备 |
| 2.2.3 主要药品和试剂 |
| 2.2.4 溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验分组 |
| 2.3.2 大鼠离体心肌缺血再灌注模型的构建 |
| 2.3.3 大鼠离体心脏停跳-再灌注模型 |
| 2.3.4 血流动力学参数的测定 |
| 2.3.5 心肌酶的检测 |
| 2.3.6 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 KP-4改善左前降支冠脉结扎再灌注模型大鼠心脏的收缩功能 |
| 2.4.2 KP-4改善停跳-再灌注模型大鼠心脏的收缩功能 |
| 2.4.3 KP-4降低停跳-再灌注模型大鼠的心肌酶含量 |
| 2.5 本章讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 KP-4 抑制H_2O_2诱导的H9c2 心肌细胞氧化应激损伤 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞系及其来源 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 主要药品和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 H9c2心肌细胞的培养 |
| 3.3.2 实验分组 |
| 3.3.3 细胞的处理 |
| 3.3.4 细胞活力的检测 |
| 3.3.5 乳酸脱氢酶(LDH)释放的检测 |
| 3.3.6 H9c2细胞形态的观察 |
| 3.3.7 细胞核形态的观察 |
| 3.3.8 细胞凋亡和坏死的检测 |
| 3.3.9 细胞内活性氧化合物(ROS)的检测 |
| 3.3.10 细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性检测 |
| 3.3.11 细胞内丙二醛(MDA)含量检测 |
| 3.3.12 BCA法检测蛋白质浓度 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 H_2O_2对H9c2细胞活力的影响 |
| 3.4.2 H_2O_2对H9c2 细胞LDH释放的影响 |
| 3.4.3 KP-4对H9c2细胞活力影响 |
| 3.4.4 KP-4 预处理抑制H_2O_2 诱导的H9c2 细胞活力的下降 |
| 3.4.5 KP-4 预处理抑制H_2O_2 诱导的H9c2 细胞LDH的释放 |
| 3.4.6 KP-4 预处理抑制H_2O_2 诱导的H9c2 细胞形态的改变 |
| 3.4.7 KP-4 预处理抑制H_2O_2 诱导的H9c2 细胞核形态的变化 |
| 3.4.8 KP-4预处理抑制氧化应激诱导的H9c2细胞凋亡和坏死 |
| 3.4.9 KP-4 预处理降低氧化应激时H9c2 细胞中的ROS水平 |
| 3.4.10 KP-4 预处理提高H9c2 细胞中的SOD的酶活性 |
| 3.4.11 KP-4 预处理显着降低H9c2 细胞中的MDA含量 |
| 3.5 本章讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 KP-4 通过Akt/GSK-3β信号通路和HK-II途径抑制氧化应激诱导的H9c2 细胞损伤 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 细胞系及其来源 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 主要药品和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 H9c2心肌细胞的培养 |
| 4.3.2 实验分组 |
| 4.3.3 细胞的处理 |
| 4.3.4 线粒体膜电位的检测 |
| 4.3.5 线粒体蛋白的提取 |
| 4.3.6 Western blot检测蛋白含量 |
| 4.3.7 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 KP-4 上调H9c2 心肌细胞氧化应激时Akt的磷酸化水平 |
| 4.4.2 KP-4 抑制H9c2 心肌细胞氧化应激时GSK-3β的磷酸化水平的降低 |
| 4.4.3 KP-4 促进HK-II与线粒体的结合 |
| 4.4.4 KP-4抑制氧化应激诱导的H9c2心肌细胞线粒体膜电位下降 |
| 4.4.5 KP-4 调节Bcl-2/Bax水平 |
| 4.4.6 LY294002 抑制KP-4抗H9c2 细胞氧化应激损伤 |
| 4.5 本章讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、大鼠心肌缺血再灌注时心肌细胞凋亡情况及缺血预处理对其影响（论文参考文献）
- [1]电针预处理对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用及FXR/SHP通路的调控作用[D]. 李晨. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [2]益气活血中药调节线粒体自噬改善心肌细胞缺氧复氧损伤的机制研究[D]. 夏君彦. 北京中医药大学, 2021(08)
- [3]OGT介导的RIPK3 O-GlcNAc糖基化在七氟醚后处理抑制心肌缺血再灌注损伤时程序性坏死中的作用[D]. 张静. 南昌大学, 2020(01)
- [4]基于mTORC1-ULK1-FUNDC1通路的电针预处理减轻MIRI的线粒体自噬机制研究[D]. 肖燕. 南京中医药大学, 2020(01)
- [5]基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制[D]. 刘岩松. 长春中医药大学, 2020(08)
- [6]定心藤活性成分抗心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究[D]. 杨小琪. 江西中医药大学, 2020(05)
- [7]右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究[D]. 彭科. 苏州大学, 2020(06)
- [8]蒙药当贡-3通过PI3K/Akt信号通路干预心肌缺血再灌注损伤大鼠的机制研究[D]. 宁小伟. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [9]蒙药当贡-3对大鼠缺氧-复氧心肌细胞活性影响的研究[D]. 杨潇. 内蒙古医科大学, 2020(03)
- [10]KP-4对缺血再灌注损伤的心肌保护作用及其机制研究[D]. 张晓锋. 广东工业大学, 2020(06)