一、TTV DNA 定量检测系统之开发与临床应用（论文文献综述）
骆延波[1]（2021）在《高通量细菌药敏检测仪器的研制及应用》文中认为研制的细菌药敏试验高通量检测仪器包括高通量药敏试验接种仪、96点阵琼脂检测盒、便携式细菌培养箱、药敏试验图像采集转换仪等,实现了细菌药敏试验高通量检测技术的准确性、稳定性、标准化。根据美国临床实验室标准化协会药敏试验稀释法标准,对药敏试验接种仪的结构和操作稳定性、重复性、与CLSI药敏标准方法比对验证等性能进行了研究,并使用该药敏试验接种仪方法与CLSI药敏标准微量肉汤稀释法分别检测了8种抗生素对48株禽源大肠杆菌临床分离株的最低抑菌浓度。结果显示:该药敏试验接种仪便于灭菌,易于操作,结构合理,接种细菌量重复性好,与CLSI微量肉汤稀释法比对检测结果吻合率达95%,批量检测结果吻合率90%以上,检测效率高5倍以上。针对国内养殖场临床化验不具备细菌培养条件的现状,研制开发出一种便携式细菌培养箱,箱体的长、宽、高分别为40～50 cm、20～30 cm、20～30 cm,热功率为30～40 W。主要由密封的泡沫盒、加热带、电线、温控开关等组成,经过温度稳定性、温度差异性、与常规恒温培养箱培养性能比对验证及使用费用对比、实地培养应用等研究,结果表明,该便携式细菌培养箱体积小、重量轻、便于携带,箱体内温度相对恒定（温度范围30-42℃）,符合常规细菌的培养要求,与常规培养设备相比成本降低90%,适用于基层现场和实验室培养细菌。研制的药敏试验图像采集转换仪包括外壳、显示屏、图像采集室、控制板、图像采集转换装置,其中显示屏固定在壳体上,控制板、图像采集转换装置和图像采集室安装在内部,图像采集转换装置与图像采集室对应,控制板连接控制器,图像采集转换装置的数据输出端口连接控制器的数据接收端口,显示屏连接控制器。图像采集转换装置包括扫描仪和光源。CMOS感光器或CCD感光器,连接到控制器。稳定性验证结果表明药敏试验图像采集系统进出托盘和操作系统运行顺畅。每个药敏板的读数值基本一致,重复性好。与目测结果比对验证表明,两种方法检测结果一致,而且检测效率是目测的5倍以上。检测敏感性研究结果表明,图像采集仪能够识别琼脂板上直径大于0.5mm的菌落。本软件设计记忆功能,对于初次不能识别的较小直径菌落,经过软件识别标记,再次扫描时即能识别。为便于操作,撰写了96点阵药敏计算机采集系统v1.0使用说明书。以上研究结果表明,药敏试验图像采集转换仪能够实现高通量图像采集和MIC统计分析,设计合理,运行稳定,读取结果重复性好,敏感性高,检测效率比常规目测和手工录入数据提高10倍以上,适合批量细菌药敏试验检测。为验证该优化集成的细菌药敏试验高通量检测仪器,使用该集成技术对分离鉴定的临床分离细菌进行了抗药性检测,在此基础上检测高抗药性基因。分离鉴定出菌株总数为10617株,主要包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠球菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌、变形杆菌等。对主要细菌进行了抗药性检测,筛选部分抗药性水平较高的细菌,对其抗药性基因进行了检测,并统计了10余种常用药物对细菌的MIC频率分布。结果表明,大肠杆菌对于氟苯尼考、恩诺沙星、氨苄西林、复方新诺明、对多黏菌素、头孢噻肟、头孢噻呋、多西环素、环丙沙星抗药率高于40%;对庆大霉素、阿莫西林-克拉维酸、左氧氟沙星、阿米卡星相对敏感。沙门氏菌的总体抗药性水平略低于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌对复方新诺明、红霉素、氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸等的抗药性高于70%,对其它药物较为敏感性低于20%。健康动物源大肠杆菌对多西环素、氟苯尼考、庆大霉素、头孢噻呋、多黏菌素的抗药性明显低于病料来源大肠杆菌。健康动物粪便源大肠杆菌在一定程度上具有养殖畜种抗药性背景指示菌的作用。多重高抗表型的大肠杆菌和致病性大肠杆菌均含有多种抗性基因,同时含有多种毒力基因。从山东省8个大型集约化养鸡场中720份新鲜粪便样品,分离鉴定到697株非重复大肠杆菌。检测结果表明:83株携带mcr-1基因;从mcr-1阳性菌株中共检测到5种ESBL基因和4种PMQR基因。药敏检测只用了1个月时间,比常规方法节省5个月,检测成本降低80%。综上所述,细菌药敏试验高通量检测技术准确、稳定、可重复、效率高,使用成本低,适应性强,为国内首创,获得国家发明专利,适用于科研、教学、生产,为细菌抗药性检测与研究提供技术支持。
左晨[2]（2021）在《以microRNA为靶标的CRISPR-Cas12a体外诊断技术及肿瘤诊疗一体化纳米探针的构建》文中研究说明miRNA是一类内源性、非编码的小RNA分子,其作为基因转录后重要的调节因子,在多种疾病的发生发展中扮演着重要的作用,如癌症、神经系统疾病、自身免疫性疾病等。循环miRNA常存在于微囊和凋亡小体中或与高浓度脂蛋白偶联,具有较高的稳定性,是液体活检领域最具应用潜力的生物标志物之一。目前,传统的miRNA检测技术可分为三类:基于杂交原理的检测技术,如Northern印迹分析、微阵列芯片等;基于扩增原理的检测技术,主要是RT-PCR方法;以及基于测序的检测技术。以上方法或耗时长、灵敏度低,或成本高、且需要复杂的数据分析。因此,临床对开发灵敏度高、特异性好、简单快速的miRNA检测技术提出更高的要求。与miRNA的体外检测方法相比,细胞内miRNA的荧光成像技术可实时监测miRNA时空维度的动态变化,为阐明miRNA功能、监测疾病进程提供了新方法。但该技术多面临荧光信号不稳定、光漂白或生物自发荧光干扰等问题;且在诊疗探针的构建策略中,药物的递送系统难以与miRNA原位成像结合,无法满足诊疗一体化的需求。针对以上问题,本论文基于CRISPR-Cas12a荧光放大系统及miRNA的等温扩增技术,建立了miRNA灵敏快速的体外检测新方法;基于UCNPs及MOF材料的独特性质,结合DNA功能化介导的响应型药物递送系统,实现了对肿瘤细胞中miRNA的近红外成像及miRNA靶标响应的药物特异性释放。具体研究内容如下所示:1基于DSN酶介导的靶标循环放大及CRISPR-Cas12a荧光放大系统的miRNA检测研究基于CRISPR、Cas核酸酶及crRNA的复合系统可对特定基因位点进行编辑。随着对CRISPR-Cas系统的不断研究,Cas12a蛋白的顺式和反式切割活性先后被发现,即crRNA特异性识别靶标DNA后,在激活Cas12a顺式切割活性的同时,可通过反式切割活性对非特异的单链DNA进行无差别地切割。在此基础上,通过引入带有荧光基团及猝灭基团的FRET信号单链,即可实现对靶标核酸的高效快速检测。基于以上特性,国内外研究人员建立了基于Cas12a的DETECTR及HOLMES检测系统,为核酸检测领域提供了全新的体外诊断技术平台。因此,我们首先探讨了该平台在miRNA体外检测中的应用价值。由于CRISPR-Cas12a系统只能识别双链DNA或单链DNA靶标,激活其切割活性,因此构建miRNA为靶标的CRISPR-Cas12a检测策略需要输出可被Cas12a识别的TS链。因此,本研究首先构建了miRNA捕获探针修饰的功能化磁珠,该探针在3’端有一段poly A的spacer区域,中间为靶标miRNA的捕获区域,5’端为一段可激活CRISPR-Cas12a系统的TS区域。探针可捕获miRNA靶标形成DNA-RNA双链,利用DSN酶水解双链中杂交的DNA区域,实现miRNA循环利用的同时,将TS片段释放到缓冲液中,以激活CRISPR-Cas12a系统中的反式切割活性,进一步耦合“核酸编码技术”及CRISPR-Cas12a/crRNA阵列,实现了对多种miRNAs单管放大,多管输出的多重检测。该方法可对单一miRNA-21靶标实现灵敏特异的检测,线性检测范围为0.1 n M-50n M,最低检测限约为12.6 f M,可满足临床中大多数miRNA的检测需求;同时,该方法可在1.5小时内高效完成对四种miRNAs的多重检测,为构建疾病的miRNAs图谱奠定了基础。2基于双重链置换扩增技术及CRISPR-Cas12a荧光放大系统的miRNA检测研究在上一部分中,我们利用所构建的miRNA的检测方法,实现了对多种miRNAs的有效检测。虽然该方法的建立拓展了目前miRNA检测方法的构建思路,但其检测性能仍可进一步提升,如检测时间较长,前端DSN酶的处理时间为1小时左右;检测下限为f M级别,对某些表达丰度较低的miRNAs而言,仍有进一步提高的空间。针对以上问题,miRNA检测中靶标快速高效的预扩增显得尤为重要。与依赖精确温度控制和复杂仪器的常规PCR方法不同,等温扩增技术可在恒温条件下对靶标进行快速及有效地扩增。因此,本研究构建了一种基于切口引物介导的双重链置换扩增技术。该切口引物从5’至3’端分别为链置换固定区、切口酶识别区及靶标识别区。反向引物可通过靶标识别区与miRNA结合,在聚合酶及切口酶介导的链置换扩增作用下,产生大量DNA单链产物,正向引物则可通过靶标识别区与单链扩增产物结合,基于以上原理,生成与靶标序列一致的DNA单链产物,从而实现双重链置换扩增反应的不断循环及等温条件下靶标的指数级放大。后端结合CRISPR-Cas12a荧光放大系统,实现了对miRNA-21高效、超灵敏的荧光检测。该方法前端扩增时间仅需20分钟,且线性检测范围为1 f M-10 p M,检测限低至450 a M,同时该方法对单碱基突变具备一定识别能力。通过与其他检测平台及方法的对比,本方法展现出优秀的检测性能及检测效率。3基于DNA功能化的上转换诊疗探针用于肿瘤细胞中miRNA荧光成像及药物靶向递送的研究miRNA作为癌症分子诊断和治疗的重要的生物标志物,是目前诊疗探针构建中的常见靶标。其中基于有机荧光染料、量子点或无机纳米颗粒修饰的核酸探针是目前miRNA荧光成像的主要手段,但其多面临生物体自发荧光干扰、光漂白现象等问题。同时,探针在药物递送过程中,装载物的释放多基于环境温度或p H值,易受生理和病理条件的影响,产生明显的毒副作用。针对上述问题,本研究基于UCNPs在近红外光激发下独特的上转换性质及MOFs高效的装载效率及易功能化特点,制备了UCNP@MOF核壳复合物,进一步结合核酸功能化的药物响应释放系统,构建了一种新型的纳米诊疗探针UCNPs@MOF/DOX。该探针可通过miRNA-21响应的链置换反应介导药物的精准释放,并利用UCNPs与DOX之间的FRET实现对miRNA-21的检测,其中DOX从探针中的释放经历了两个阶段的动力学过程:一是由靶标特异性触发,并与靶标浓度成正比的快速释放阶段,二是由于Zr-MOF（UIO-66-NH2）外壳与缓冲体系中磷酸盐发生配体交换,导致结构坍塌,引起药物缓慢释放的阶段。此外,该纳米探针显示出良好的检测特异性,线性范围为4 n M-500 n M,检测限为4 n M,可有效规避正常细胞中内源性miRNA-21低丰度表达而导致的药物泄漏。此外,基于核仁素适配体AS1411介导的肿瘤细胞识别及靶标响应性释放的双靶向递送系统,该探针可实现对乳腺癌细胞MCF-7中miRNA-21的特异成像及高效杀伤,其生存率下降约35%。本研究为纳米材料在精准诊断及个性化治疗的应用提供了新思路。
尹居鑫[3]（2021）在《数字PCR微流控芯片的一体化及多重化方法的开发及应用》文中研究说明基于微流控技术的数字PCR技术在近十年来发展迅速,由于其独特的优势及产业化前景,在癌症早期诊断,病原菌检测,产前诊断等领域得到了广泛应用。尽管数字PCR在精准定量方面表现出了突出优势,然而其集成化及多重化发展一直受到限制。数字PCR芯片的集成化可以实现“样本进-数字式-结果出”的精准定量方式,提高检测效率以及检测结果的准确性及稳定性。多重数字PCR有利于提高检测过程的高效性、经济性以及系统性。本论文围绕数字PCR芯片的集成化及多重化的方法进行了研究并开展了初步应用,主要研究内容如下（1）针对数字PCR的集成化发展,建立了快速核酸提取方法,开发了能够与数字PCR芯片集成的基于聚四氟乙烯管路的核酸提取系统。该系统以聚四氟乙烯管装载试剂,利用水油的两相界面张力结合高效的磁珠法核酸提取方式完成核酸提取。以PCR反应预混液作为洗脱体系,获得的核酸在洗脱完成后可以直接进入数字PCR芯片进行反应。以矿物油相进行界面分隔,在完成核酸提取后可以直接进入数字PCR芯片中进行物理分隔。该系统可以在5分钟内从细胞及血液中完成核酸提取并直接与数字PCR芯片相集成,从而对核酸分子进行精准定量,实现“样本进-数字式-结果出”检测方式,在核酸快速提取及数字PCR芯片的一体化集成方面具有重要的应用价值。（2）为了同时实现芯片的一体集成及多重检测,开发了集成核酸提取与多重数字RPA的微流控芯片并将其应用于多种病原菌的检测。利用磁珠法核酸提取方法及特殊的芯片设计,实现了利用单一油相完成核酸提取试剂的有效分隔。利用螺丝阀门及单独设计的进样口在数字RPA芯片上实现了 4种引物探针的预包埋。该芯片可以在15分钟内完成核酸提取,30分钟内实现扩增检测,整个检测过程仅需45分钟。利用该芯片本文成功从模拟样本（牛奶）中检测出3种病原菌,实现了“样本进-数字式-结果出”的检测方法。（3）为了进一步提高数字PCR芯片的多重检测性能,实现高阶的数字PCR检测并降低芯片的加工操作难度,本文开发了一款新型的多重数字PCR芯片。该芯片利用单独设计的进样口,基于自吸分液原理,无须任何外源的泵阀结构便可实现利用单色荧光完成6种靶标的数字PCR检测。芯片利用聚二甲基硅氧烷加工而成,具有六个检测区域和四层结构。利用已知浓度的标准品及实时数字PCR检测证明了芯片的精准定量性能。以5种EGFR突变位点标准品的检测结果并与商业化数字PCR仪进行结果比较,证明了芯片多重检测性能的准确性。最后,作为概念性验证,本文成功对15例肺癌病人的EGFR突变位点进行了检测,证明了该芯片具有潜在的临床检测价值。综上所述,本文围绕数字式微流控芯片的集成化及多重化开展了研究,开发了集成数字PCR芯片的核酸提取方法,实现了数字式检测芯片的一体集成及多重检测,开发了高阶的多重数字PCR芯片并进行了初步应用。
李彬[4]（2021）在《基于不同微流控体系的实时PCR装置光电检测系统研究》文中研究说明本课题基于不同微流控体系的实时PCR装置进行荧光光电检测系统的研究。针对具有特殊设计的实时荧光定量PCR系统和数字PCR系统分别进行了研究实验和测试。实时荧光定量PCR系统基于帕尔帖半导体实现温度循环,这样的系统不允许连续拍摄。因此,从光电控制的角度出发,将普通PCR仪与智能手机/相机相结合,进行了光电反馈自动荧光检测系统的设计。该检测系统通过比较屏幕上选定像素区域的变化控制智能手机/相机拍照,并实现自动照片反馈。该方法大大提高了拍摄时间的准确性和照片的清晰度。使本不具备荧光检测能力的普通PCR仪获得了实时荧光定量PCR仪的功能。3D微流控芯片仅需单个加热源便可形成基因扩增所需的温度条件,这使得微滴生成装置不依赖昂贵的芯片。将CMOS图像传感器（CMOS相机）用作检测工具,能够获取整个温度循环区域或指定循环区域的荧光视频,配合视频处理软件能够全局监测PCR的各个阶段,获取基因各个阶段的扩增信息。芯片式数字PCR仪是目前应用最广泛的PCR设备。将上述3D微流控数字PCR荧光检测系统以适用低成本的数字PCR芯片温度循环平台为目标进行再设计和光学优化,得到了新的芯片式数字PCR荧光检测系统。实验证明该系统在核酸试剂的通用性方面要远高于商业化数字PCR系统。以上PCR系统在本课题的荧光检测系统的助力下实现了对灭活HBV血清样本的分析,并获得了与商用PCR仪相同的结果。在保持了稳定响应的同时大大减小了整个系统的尺寸和成本。
赵俊[5]（2020）在《微流控数字等温扩增技术研究及其在肝癌miRNA检测的应用》文中研究说明肝癌被誉为“癌中之王”,是最常见的恶性肿瘤之一。中国每年新发肝癌患者约占全球一半以上,死亡率在所有恶性肿瘤中位列第二位,严重威胁人民的生命和健康。肝癌起病非常隐匿,早期无明显症状。约80%的肝癌患者首诊就已进入中晚期,5年生存率几乎为零,而早期肝癌患者经过治疗,5年生存率可达60%以上。因此,早诊早治是对抗肝癌的重要手段。甲胎蛋白（Alpha fetoprotein,AFP）作为一种血清标志物,是诊断肝癌的常用指标。然而,AFP检测的灵敏度较低,仅有60%～70%的早期肝癌患者AFP值呈阳性。同时,常规的影像学检查,如B超和CT难以发现肿瘤直径小于2 cm或密度近似肝实质的早期肝癌。因此,早期肝癌诊断仍面临较高的假阴性率及漏诊率。随着科学的发展和进步,以液体活检（Liquid biopsy）这种侵入式小、灵敏度高的肿瘤诊断技术应运而生。其中,循环miRNA分子标志物检测已被写入2019版《原发性肝癌诊疗规范》,并被纳入肝癌早期检测和诊断临床应用。然而,miRNA是一类长度较短的RNA单链分子,且学术界尚未确定一种合适的miRNA内源性参照基因,极大地影响了其定量结果的准确性,也是一直限制miRNA标志物在肝癌早期诊断中广泛应用的重要因素。近年来,随着等温扩增技术的快速发展,其在核酸分子检测效率和灵敏度方面展现出较大优势,特别适合miRNA类小分子的检测。同时,微流控芯片技术的兴起,极大地推动着以数字核酸扩增检测（Digital nucleic acid detection,dNAD）技术为代表的“第三代”基因扩增技术的发展。借助于高通量微流控芯片微纳米级反应单元,可以实现单分子独立分割和有效扩增,且无需借助内参基因的标定,实现基因的绝对定量。因此,本研究充分利用miRNA分子标志物可以作为肝癌早期诊断的学术共识,开展微流控数字等温扩增技术研究及其在肝癌miRNA检测中的应用,主要内容如下:基于链置换扩增技术（Strand displacement amplification,SDA）原理出发,结合miRNA分子的特殊结构,创新性地设计了一系列荧光自抑制探针,并以此建立了一种无背景荧光探针链置换指数扩增（BF-ESDA）检测系统,该方案能够有效地提高低浓度miRNA的检测信噪比,特别适合临床样本中痕量miRNA分子的检测。在90分钟内,可以实现9个数量级的动态检测范围,检测限可达0.08 aM。另外,基于微流控芯片技术,设计并制备了一种自吸分液式高通量微流控芯片。该款芯片可根据目标分子的浓度差异,同时满足1个、2个、4个甚至8个独立样本的检测需求,整个进样和油封过程仅需2～3分钟。通过防蒸发密封、分液均一性、油液稳定性,和生物兼容性等一系列试验,确认该款芯片能够满足数字等温扩增检测需要,是实现miRNA分子绝对定量的有效载体。为了丰富肝癌miRNA分子标志物数据库,通过数据库和生物信息学分析,临床样本试验,发现并鉴定3个miRNAs（hsa-miR-185、hsa-miR-4311和hsa-miR-1255b）在肝癌患者和健康受试者血清中的表达差异极显着（P＜0.01）。同时,还确认hsa-miR-4644在表达丰度和稳定性方面均优于目前已知的miRNA内参基因。为了建立一套肝癌早期预警模型,提高肝癌患者的检出率和生存率。联合本研究发现的hsa-miR-185、hsa-miR-4311、hsa-miR-1255b和文献中报道的miR-21、miR-26a、miR-192、miR-143分子标志物,以及AFP血清标志物进行Logistic回归分析,采用ROC曲线评价它们在肝癌早期诊断中的效能。结果表明,以这7个miRNA和AFP组成的诊断模型,当满足一定条件时,判断受试者是否患有肝癌的敏感度可达95.24%,特异度可达80.95%。经临床样本验证,发现其误诊率仅为7.14%。因此,该诊断模型可以有效地发现并诊断早期肝癌。综上所述,以新型无背景荧光探针链置换等温扩增技术为检测方法;以自吸分液式高通量微流控芯片为检测载体;以miRNA分子标志物为检测目标,开展了用于肝癌miRNA分子标志物绝对定量的数字等温扩增技术研究,并最终建立了一套肝癌早期诊断预警模型,为提高肝癌患者的检出率和生存率提供了一种有效的解决方案。
徐欢[6]（2020）在《基于3D打印及智能手机的多能iPOCT检测平台的构建及其在DNA和生化标志物检测中的应用》文中提出研究背景DNA和生化标志物在生命科学中发挥着越来越重要的作用,广泛应用于临床诊断、环境监测、食品安全和农作物保护中。目前,DNA和生化标志物的检测仍然主要依赖于现代化的实验室环境、昂贵的仪器设备和专业的操作人员,这限制了DNA和生化标志物检测在疾病现场或资源有限地区的应用。即时检测（Point-of-care testing,POCT）具有快速、简便、高度集成,不依赖大型仪器设备和专业工作人员等优点,在资源有限的地区具有巨大的潜力。但是现有的即时检测技术仍然存在以下限制:首先大部分设备只能实现一个或几个环节上的POCT,如核酸扩增或结果读取,无法全流程地完成“sample-to-answer”的检测;其次即时检测设备往往只针对一种或少数几种DNA靶标类型和样本来源,无法实现多用途的平台式检测。综上,本研究在即时检测技术现有发展基础上,针对DNA和生化标志物,建立了全新的智能即时检测平台（intelligent Point-of-care testing,i POCT）,并对其临床应用性能进行了系统的评价,对即时检测平台的深入开发和转化提供了一定的研究基础。研究目的1.建立超便携、多功能的DNA智能即时检测平台;2.对DNA智能即时检测平台的临床应用性能进行评价;3.建立生化标志物智能即时定量检测平台;4.对生化标志物智能即时定量检测平台的临床应用性能进行评价。研究方法1.采用3D打印技术和微流控技术,设计构建包含3D打印前处理单元和微流体信号放大单元的集成芯片。设计可折叠支架,并搭建手机光路系统。设计智能手机应用程序,开发智能手机温控系统和结果读取系统。利用恒温重组酶聚合酶扩增与金-银纳米颗粒结合的方法,构建i RPAS（isothermal Recombinase Polymerase Au-Silver,iRPAS system）三重信号放大系统。利用地中海贫血全血样本、细菌感染尿液样本、唾液样本,测试DNA智能即时检测平台对不同类型的基因突变、尿液细菌感染和单核苷酸多态性（SNP）的检测效果。利用细菌污染牛奶样本、细菌污染河水样本、细菌感染植物叶片样本,测试DNA智能即时检测平台对食品样本、环境样本和农作物样本的检测效果。2.通过恒温烘箱模拟不同环境温度测试智能手机温控系统在极端环境下的检测效果和电池耗电量。构建基因突变质粒,通过质粒DNA进行检测平台灵敏度和理论检测下限测定。通过每周测定常温放置的i-chip,分析i-chip在没有冷链保存情况下的稳定性。通过比较受过训练与未受过训练的用户组间的检测效果,分析检测平台的易操作性。通过使用不同品牌的智能手机测试DNA检测平台在不同品牌智能手机间的稳定性。通过检测172例临床样本,分析平台对不同类型基因突变、SNP、细菌检测的准确性、阳性预测值、阴性预测值。3.利用侧向层析技术和3D打印技术构建血浆分离模块,通过显微镜观测血浆分离模块对血浆的分离效果。利用3D打印技术构建检测模块,通过不同浓度血清化学质控品进行生化反应,分析检测模块的稳定性。利用智能手机环境光传感器并设计相应应用程序进行透射光强度的记录和浓度换算。4.使用血清化学质控品测定即时生化标志物智能定量检测平台对总胆红素和直接胆红素的线性范围和检测灵敏度。通过血液中10种干扰生化标志物来分析检测平台的对总胆红素和直接胆红素的检测特异性。通过真实血浆中掺入血清生化质控品,来评估检测平台的回收率。通过检测19份临床血液样本,验证检测平台在临床全血样本中对总胆红素和直接胆红素的定量性能,并与全自动临床化学分析仪进行比对。通过使用Passing-Bablok回归、Bland-Altman差异图分析和Kappa检验分析平台与临床化学分析仪的相关性和一致性。研究结果1.通过3D打印技术和微流控技术建立了由i-chip和f-box组成的POCKET DNA检测平台。平台重量不足100 g,长度小于25 cm。建立并优化了i RPAS三重信号放大系统,iRPAS结果可通过智能手机进行半量化分析。搭建了智能手机温控系统,并设计了在寒冷环境下使用的保温袋。POCKET DNA检测平台在检测各种类型的基因突变、SNP、细菌感染时,阳性标本和与对照组之间有明显的信号差异（p<0.05）。POCKET DNA检测平台在检测血液、尿液、唾液、牛奶、河水、树叶时,实验组与对照组之间有明显信号差异（p<0.05）。2.智能手机温控系统在不同的环境温度下（4°C、15°C、25°C、37°C）达到并维持37°C所需的时间均不超过20 min,并且在所有测试温度下均获得显着的强信号。手机电量至少可以完成四次完整检测。DNA智能即时检测平台检测下限在103-104copies/m L左右,计算可得理论灵敏下限为113 copies/m L。i-chip在10周的观察时间内检测效果保持稳定。训练与未经训练的用户检测效果类似,没有显着差异。使用三个不同品牌的智能手机得到的检测结果之间也没有显着差异。POCKET平台用于临床样本检测的总准确度为97.1%,每个靶标AUC都超过0.950,特异性均大于77.8%,PPV大于88.2%。3.通过侧向层析技术和3D打印技术成功构建了包含血浆分离模块和检测模块的即时生化标志物智能定量检测平台,平台总重量不足40 g,成本不足5美元,整个检测周期小于5 min。在血浆分离试纸条尾部血浆分离效果最好,可用于后续血浆转运。无论是高、中还是低浓度,检测模块在30 min观察时间内均非常稳定。设计的“Light to Concentration”智能手机应用程序,可对智能手机环境光传感器光强度值进行读取和记录并将其转换为生化标记物的浓度。4.总胆红素在1.0μM至30.3μM范围内具有良好的线性回归,检测下限为0.8μM,校准曲线回归方程为y=10.86*ln（x）+4.17。直接胆红素线性回归范围为0.7μM至21.3μM,检测下限为0.5μM,校准曲线回归方程为y=19.5*ln（x）+15.00。血液中10种检测波长接近胆红素的生化标志物在总胆红素和直接胆红素检测中光强度信号没有显着变化。与总胆红素和直接胆红素的光强度信号之间有显着差异。总胆红素和直接胆红素的平均回收率均高于95%。总胆红素的准确性为89.5%,阳性预测值为100.0%,阴性预测值为84.6%。直接胆红素的准确性为94.7%,阳性预测值为90.0%,阴性预测值为100.0%。Passing-Bablok回归分析、Bland-Altman差异图分析和Kappa检验都表明,我们的平台与临床化学分析仪具有良好的相关性和一致性。研究结论1.我们建立了一个超便携、多功能的DNA智能即时检测平台。首先,该平台具有超便携的特点,整个平台重量小于100 g,体积小于1 L,从样本制备到信号放大到结果读取全流程无需仪器设备。我们开发了i RPAS三重信号放大技术和智能手机温控系统。智能手机可作为温控系统、信号检测器和结果读数装置,从而实现了恶劣环境下也可以进行即时DNA扩增。其次,该平台具有多用途的特点,从临床样本（血液、尿液和唾液）,环境样本（河水）,食品（牛奶）,农业样本（植物叶片）等各种样本来源中检测了不同类型的DNA包括各种类型的基因突变、SNP、细菌DNA。2.我们的平台在不同的环境温度下均能良好运行。平台检测灵敏、特异（单碱基特异性）、快速（<2 h）、稳定（在室温下至少保存10周）,用户友好、兼容不同品牌智能手机。通过分析并测定了172份临床样本,证明我们的平台对于基因突变、细菌感染和SNP检测均有极佳的检测性能。3.我们建立了一个即时生化标志物智能定量检测平台,实现了全血样本中sample-to-answer的生化标记物定量检测。平台集成了血浆分离模块和检测模块。血浆分离模块实现了快速血浆分离。检测模块实现了无需移液器进行生化反应。通过智能手机环境光传感器和我们设计的应用程序,实现了光强度值的读取和记录并将其转换为生化标记物的浓度。通过总胆红素和直接胆红素我们验证了平台的可行性。4.即时生化标志物智能定量检测平台具有很好的便携性（<40 g）,低成本（<5美元）,快速（<5 min）,无需仪器,高灵敏度（<1μM）。并且我们平台具有较好的特异性和回收率。通过分析并测定了19份临床样本并与全自动临床化学分析仪进行比对。我们的平台对临床样本的定量性能与临床化学分析仪具有较好的一致性。
徐晓宇[7]（2020）在《基于BD光盘纠错原理的嵌入式定量检测系统与仪器的研发》文中研究说明蓝光光盘（BD）是目前存储容量最大的光盘存储介质,用于高质量影音和大容量数据的保存。在生化分析领域,基于蓝光技术的数字化分子检测方法将BD光盘作为低成本的生化反应基底,将BD光驱作为高灵敏度的生物信号读取装置,已实现了医疗诊断、食品安全等领域中多种样本的定量检测,在即时检测（point of care test,POCT）应用方面具有广阔前景。然而,目前该方法存在结果分析依赖于电脑、不适用于现场应用的问题,为实现更加便捷的现场快速检测,需开发基于蓝光技术的专用性POCT仪器。嵌入式系统是经过软硬件定制而实现用户特定功能的专用计算机系统,是设计、开发POCT医疗仪器的支持性技术,可满足POCT仪器便携、低成本、操作简单的要求。本文以BD光盘/光驱生化分析传感系统为基础,开展了基于BD光盘纠错原理的嵌入式定量检测系统与仪器的研究与开发工作。以BD光盘作为生化反应的基底,以BD光驱作为生物信号读取装置,利用嵌入式开发技术设计并构建了检测系统的软硬件体系,控制嵌入式检测系统实现生物光盘上样品的自动化定量检测。本文的主要研究内容如下:1.采用嵌入式Linux和ARM处理器开发方案,完成了嵌入式底层软硬件平台的开发移植工作。通过移植QPx Tool光盘质量诊断软件,结合喷墨打印的墨点阵列光盘验证了嵌入式平台下生物光盘纠错的可行性,且检测系统的横向分辨率小于100μm。2.开发了嵌入式检测系统的自动化数据处理和结果分析应用程序,并通过QT开发了检测系统的人机交互界面。将底层软件和应用软件固化到硬件存储器中,并通过3D打印实现硬件集成,实现了小型化、集成化和样品自动化检测分析的嵌入式检测仪器的开发。3.结合PDMS微通道在BD光盘上进行了生物素-链霉亲和素结合反应和银染信号放大反应,利用所开发的嵌入式检测仪器实现了链霉亲和素浓度的自动化定量检测,验证了系统的自动化检测流程和检测结果的准确性。
潘宇祥[8]（2020）在《抗肿瘤药物与贝类毒素检测的3D细胞与分子传感器的研究》文中研究说明药物开发和食品安全是与人类健康和发展休戚相关的问题。传统药物开发的周期久、成本高、成功率低,最终能通过药监部门审批上市的候选药物寥寥无几。为了提高药物开发的成功率,临床前研究阶段的药理学研究尤其是药效学分析的准确性具有至关重要的影响。在食品安全方面,日益严重的环境破坏导致贝类毒素污染的海洋水产品越来越多。贝类毒素通过食物链的传递作用,严重威胁了人类的健康和公共安全。因此,对于高精度的药物筛选传感器和高灵敏度的贝类毒素检测传感器的研究具有十分重要的意义。本论文以生物传感器技术为基础,针对生命健康领域中的药物筛选和毒素检测对于高精度、高灵敏传感器的需求,开展了用于药物筛选的3D细胞传感器和用于毒素检测的分子传感器研究。3D细胞传感器采用更接近于在体情况的3D细胞作为敏感元件,与特殊设计的传感器芯片耦合,构建了 3D细胞阻抗传感器,用于3D细胞生长状态动态监测和抗肿瘤药物筛选;分子传感器采用高度特异性和亲和性的抗体和适配体作为敏感元件,以免疫磁珠和叉指电极作为换能器,建立了两种用于贝类毒素高灵敏现场快速检测的方法。本文的主要研究内容和创新性工作包括:1、提出了 3D细胞传感器的分析模型,设计加工了一种工艺简单的3D细胞阻抗传感器芯片,实现了对3D细胞生长状态的动态监测。本文开发了一种动态、实时、无标记的3D细胞传感器用于3D细胞的生长状态及药物敏感性监测。针对3D细胞培养方式与2D细胞培养的区别,重新建立了 3D细胞等效电路模型并仿真验证。设计加工了 3D细胞阻抗传感器芯片,结合电化学阻抗检测技术对细胞/凝胶混合物的总体阻抗值进行分析,提出了实时监测3D细胞生长状态的新方法,动态监测了 3D肝癌细胞的生长状态及抗肿瘤药物作用后的细胞活性变化。实验结果表明,本论文研制的3D细胞传感器可以有效地用于3D细胞生长状态检测和药效评价,与金标准荧光染色法具有较好的一致性,相比2D细胞传感器具有更高的药物筛选准确度,是一种很有潜力的抗肿瘤药物筛选的方法。2、提出了基于微纳技术的3D细胞阻抗传感器的加工工艺,设计了具有特殊微腔结构用于3D肿瘤细胞活性及药物作用高通量监测的传感器芯片。本文采用微纳技术设计加工了稳定性和测试通量更高的3D微腔阻抗传感器（MGIS）芯片,用于3D细胞生长状态动态监测。针对3DMGIS芯片结构和电极尺寸的变化,重新测试优化了电化学阻抗检测的工作参数,调整了 3D细胞等效电路模型并仿真验证。建立了 3D肺癌细胞模型,与3D MGIS芯片耦合构建了 3D肺癌细胞传感器,对顺铂、吉西他滨和培美曲塞等肺癌相关治疗药物进行了作用效果评价。实验结果表明,3D MGIS芯片可以高通量地动态监测3D肺癌细胞的生长状态,与荧光共聚焦显微镜检测结果具有高度一致性。同时,与2D肺癌细胞传感器的对照实验表明,3D肺癌细胞传感器可以有效地区分出不同种肺癌药物之间的疗效差异,有效提高了细胞水平的抗肿瘤药物筛选准确度。3、提出了一种基于便携式流式细胞仪结合磁珠免疫传感器的贝类毒素检测方法,相对于标准检测方法具有检测下限低、精度高以及检测时间短的优点。本文选用链霉亲和素偶联的磁珠作为载体,构建了基于间接竞争性抑制免疫反应的流式分析方法。将生物素化的大田软海绵酸（Okadaicacid,OA）修饰在磁珠表面构建免疫磁珠。免疫磁珠会与检测样品溶液中的游离OA毒素竞争性地与OA抗体免疫结合。随后利用荧光试剂标记的第二抗体进行信号放大,采用便携式流式细胞仪对反应后的免疫磁珠进行荧光分析。该免疫传感器对OA的检出限为0.05 μg/L,动态检测范围是0.5～20μg/L,加标回收率在92.5%～108%之间,总体检测耗时在1小时之内。贝肉样品加标回收率实验的结果说明了该免疫传感器具有良好的基质效应和实际样品检测能力。磁珠的引入简化了传统免疫传感器复杂的清洗步骤,有效缩短了检测时长,显着提升了免疫传感器的抗干扰能力。与小鼠生物法和液相色谱法等传统贝类毒素检测方法相比,流式磁珠免疫传感器具有检测下限低、检测速度快、操作简便和便携性好的特点,表明该方法适用于贝类毒素的高灵敏现场快速检测。4、提出了基于适配体传感器的贝类毒素检测方法,该传感器具有稳定性高、特异性好以及成本低的优点。本文为了满足贝类毒素现场检测低成本、高精度和高稳定的需求,利用纳米金信号放大原理,构建了以理化性质更稳定的适配体作为敏感元件的适配体传感器。将纳米金颗粒修饰在硅烷化处理后的叉指电极表面,通过静电吸附作用将OA适配体固定在叉指电极上。OA适配体会封闭纳米金的催化活性位点。待测溶液中的游离OA与OA适配体结合后,纳米金活化位点释放并开始自催化生长,引起叉指电极的导电性上升。利用线性扫描伏安法分析叉指电极的电导,进而对OA进行定量分析测定。OA适配体传感器的检出限为1 μg/L,动态检测范围是5～80 μg/L,实际样品回收率在97.68%到107.88%之间,实际样品平均回收率为103.36%,变异系数小于15%。相对抗体作为敏感元件的免疫传感器,以适配体作为敏感元件的适配体传感器在保证检测性能的同时,有效降低了检测成本,提高了检测稳定性。结果表明,结合了通用性广泛的电化学分析方法的适配体传感器比较适合在贝类毒素一线筛查中使用和推广。
胡仁建[9]（2020）在《HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备、表征及其诊断应用》文中指出背景与目的:宫颈癌是全球妇女癌症中仅次于乳腺癌居第四位的癌症,2018年全球宫颈癌发病人数57万例,死亡人数31.1万。宫颈的高危型人乳头瘤病毒（High risk human papillomavirus,HR-HPV）的持续性感染是导致宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）和宫颈癌的直接病因,其中HPV16型的发病率最高,占53%。HPV16 E7蛋白是HPV致癌的关键分子,HPV16 E7蛋白只选择性表达在肿瘤细胞中,随着宫颈上皮内瘤变从CIN1到CIN3进展,HPV16 E7蛋白的表达向外层推进越明显且表达量越来越高,最终HPV16 E7蛋白出现在宫颈脱落细胞中。细胞学检查（如TCT）联合HR-HPV DNA检测,可以增加宫颈上皮内瘤变CIN3、宫颈原位腺癌和浸润性宫颈腺癌的检出率。目前,人乳头瘤病毒（HPV）的临床检测方法主要是基于PCR的方法,但是PCR法只能用于检测HPV DNA和HPV分型,但不能检测HPV E6、E7致癌蛋白,所以预测HPV阳性癌症如宫颈癌的准确率不高。本研究的目的是针对那些细胞学检测为阴性而HR-HPV的DNA检测阳性的妇女,补充检测HPV16 E7蛋白等,即制备抗HPV16 E7蛋白的单克隆抗体并建立在蛋白质水平检测HPV16 E7致癌蛋白的化学发光免疫分析方法等,HPV16 E7蛋白的存在提示宫颈有癌细胞的存在,这很可能在宫颈上皮内瘤CIN2、CIN3时期甚至CIN1时期就发现有癌细胞的存在,具有早期预警宫颈癌的作用。方法:本研究采用基因克隆技术制备HPV16 E7蛋白;用杂交瘤技术制备抗HPV16 E7蛋白的单克隆抗体;测定和分析抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的表征,如单抗的配对、单抗的氨基酸序列和亲和力测定、单抗的优势线性B细胞表位的鉴定和保守性分析等;探索抗HPV16 E7蛋白单抗在免疫化学、免疫荧光、Western Blot等方法中定性检测天然的HPV16 E7蛋白的有效性、特异性及初步诊断价值;探索两个新的抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体79A11和69E2（79A11作为捕获抗体,69E2作为检测抗体）被用于基于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP）标记检测抗体69E2和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的常规双抗夹心ELISA法的检测系统,以及基于标记的链霉亲和素生物素（Labelled Streptavidin-Biotin,LSAB）加鲁米诺的化学发光免疫分析法的检测系统,在ng级水平定量检测宫颈内瘤病变CIN和宫颈癌等患者宫颈脱落细胞或组织中HPV16 E7致癌蛋白的诊断价值。主要结果如下:1.HPV16 E7基因的克隆、鉴定和HPV16 E7蛋白的纯化以CaSki细胞中的总DNA为模板,PCR扩增HPV16 E7基因约322bp,重组质粒pET-28a（+）-HPV16 E7中的HPV16 E7蛋白氨基酸序列与CaSki细胞株中的HPV16 E7蛋白氨基酸在第28位氨基酸上不同（28F和28L）,与SiHa细胞株中的HPV16 E7蛋白的氨基酸序列完全一致。工程菌pET-28a（+）-HPV16 E7-Rosetta（DE3）pLysS表达的HPV16 E7蛋白的分子量大约为18 kDa,其表达量高、呈可溶性表达以及二级结构为ɑ螺旋,镍柱亲和层析联合DEAE柱纯化,获得纯度大于95%的HPV16 E7蛋白。2.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备HPV16 E7蛋白免疫BALB/c小鼠的后腿足垫和腹腔5次,细胞融合前的免疫BALB/c小鼠血清的效价在1:1280001:256000。小鼠腹股沟淋巴结细胞和脾脏细胞分别与SP2/0-Ag14融合后的融合率均为100%。淋巴结细胞来源的效价高的单克隆抗体的亚型主要为IgG2a,包括69E2、69B10、54D5、54F4、54G5,其中的69A6为IgM;脾脏细胞来源的3株效价高的单克隆抗体亚型以IgM为主,以单抗79A11为代表。用二步法-辛酸-硫酸铵沉淀和Protein G纯化的IgG2a亚型的单抗69E2的纯度高达95%以上,69E2的抗体效价最高（0.19ng）;用四步法-硫酸铵沉淀加凝胶过滤层析加IgM柱加凝胶过滤层析纯化的IgM亚型单抗79A11的纯度高达95%以上,单抗79A11的效价较高,大约6.25ng。3.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体的表征8株单抗79A11,69E2,69A6,54D5,54F4,54G5,74F3和72E6通过Western blot方法与一个含有组氨酸标签的人c-Myc（HIS-c-Myc）反应,都没有出现曝光条带,排除这8株单抗与组氨酸标签反应的假阳性。这8株单抗配对56对,出现比较强的阳性信号的单抗对有4对:79A11与69E2、79A11与69A6、79A11与74F3、79A11与54D5。单抗79A11适合作为捕获抗体,单抗69E2、69A6、54D5、74F3适合做检测抗体。测定配对信号强的两对单抗共3个单抗79A11、69E2、69A6是3个新的互相不同的抗HPV16 E7蛋白的单抗,两个单抗79A11与69E2的重链和轻链氨基酸序列的差别都很大。单抗69E2与HPV16 E7蛋白之间的亲和力较高（5.60E-9M）,因为单抗79A11与HPV16 E7蛋白之间结合后被高盐洗脱下来,所以单抗79A11被认为与HPV16 E7蛋白之间没有特异性结合。3个单抗79A11、69E2和69A6的特异性表位均是外露、不连续和位置邻近的3个肽段HPV16 E749-66、HPV16 E773-85和HPV16 E791-97,都是构象性表位。3株单抗79A11、69E2和69A6的3个外露的特异性表位肽段HPV16 E749-66、HPV16 E773-85和HPV16 E791-97的氨基酸序列与从NCBI中下载的30株HPV16毒株中的HPV16 E7蛋白的氨基酸序列的同源性很高。关于3株单抗79A11、69E2和69A6的优势线性B细胞表位不同点有2个:第一是重叠肽的间接ELISA法结果显示单抗69E2与HPV16 E785-98的反应有较强的信号（p<0.01）,而2株单抗79A11和69A6与HPV16 E785-98的反应没有阳性的信号;第二是重叠肽在10μmol/L时的间接竞争ELISA的结果不同,3株单抗79A11、69E2和69A6抑制重叠肽HPV16 E749-66的抑制率依次为40.66%、94.28%和16.28%。这两个不同点提示这3株单抗的优势线性B细胞表位存在差异。4.抗HPV16 E7蛋白单克隆抗体在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用8株单抗79A11、69E2、69A6、54D5、54F4、54G5、74F3和72E6在低至7.8125 ng时与CaSki细胞进行免疫细胞化学反应,均出现棕黄色颗粒,而与HeLa细胞反应,不出现棕黄色颗粒;3株单抗79A11、69E2、69A6分别在0.895μg/片、5μg/片和1.84μg/片与HPV16阳性的宫颈癌组织进行免疫组织化学反应,都出现典型的棕黄色颗粒,与HPV18阳性的宫颈癌组织反应,都没有出现棕黄色颗粒;3株单抗79A11、69E2、69A6都在1μg/ml与CaSki细胞进行免疫荧光反应,均出现绿色荧光,而与HeLa细胞反应,不出现绿色荧光。3株单抗79A11、69E2和69A6与CaSki细胞的总蛋白进行Western Blot反应,在18kDa处出现典型的曝光条带,而与HeLa细胞的总蛋白反应,没有出现典型的曝光条带。5.单抗79A11和69E2在基于HRP-69E2和TMB的常规双抗夹心ELISA检测系统中定量检测HPV16 E7蛋白的诊断应用常规双抗夹心ELISA的优化条件为:捕获抗体79A11的最佳包被浓度是2μg/mL,检测抗体HRP-69E2的最佳工作浓度是1μg/mL,5%脱脂乳封闭2 h的本底低和信号强。双抗夹心ELISA结果显示当抗原HPV16 E7蛋白在ng级以等比等差法（0、25、50、100、200、400、600、800、1000 ng/孔）稀释时,制备的直线拟合的参考曲线的决定系数R2=0.9723。以抗原HPV16 E7蛋白在0和变异系数CV低于10%的低浓度25ng含量为横坐标,对应的OD值为纵坐标,获得计算检测限的方程为Y=0.01122*X+0.6896和决定系数R2值=0.9889,以信噪比S/N=3的高标准确定检测下限的OD450nm=3*0.6896=2.0688,检测限=（2.0688-0.6896）/0.01122=122.9234ng。因为变异系数小于20%,这个检测限也是定量限122.9234ng,所以需要探索灵敏度更高的检测系统。6.单抗79A11和69E2在基于LSAB加鲁米诺的化学发光免疫分析法检测系统中定量检测HPV16 E7蛋白的诊断应用化学发光免疫分析方法的优化条件如下:捕获抗体79A11的包被浓度是2 ug/mL,0.25%BSA封闭液封闭2 h,抗原HPV16 E7蛋白在ng级以等比等差法（0、25、50、100、200、400、600、800、1000 ng/孔）稀释与捕获抗体在37℃反应2 h,检测抗体Biotin-69E2和HRP-Streptavidin的工作浓度都为1 ug/mL,鲁米诺反应10 min等。以优化条件制备参考曲线,其直线拟合的回归方程为Y=53.35*X+10294,直线拟合和双对数拟合的决定系数R2依次为0.9666和0.956;以抗原HPV16 E7蛋白在0和低浓度25 ng的含量为横坐标,对应的相对光度（relative light units,RLU）值为纵坐标,获得计算检测限的回归方程Y=363.1*X+3441,R2=0.9823,信噪比S/N=3的RLU=3*3441=10324,检测限=（10324-3441）/363.1=18.9562ng。因为变异系数小于20%,这个检测限也是定量限18.9562ng,与常规双抗夹心ELISA法定量检测HPV16 E7癌蛋白的定量限122.9234 ng相比,灵敏度提高6.48倍。将标本的RLU值带入方程Y=53.35*X+10294,结果显示4个正常宫颈组织和4例HPV52阳性的宫颈癌组织的总蛋白20μg中的HPV16 E7蛋白含量都小于定量下限18.9562 ng;12例HPV16阳性的宫颈癌组织的总蛋白20μg中的HPV16 E7蛋白含量波动在102.1743438.2473 ng,与正常组织和HPV52阳性宫颈癌组织中的HPV16 E7蛋白含量相比有显着差异（p<0.01）。结论:本研究制备了分子量大约18 kDa、呈可溶性表达、二级结构为ɑ螺旋的HPV16 E7蛋白,获得两株新的不同的抗HPV16 E7蛋白的代表单抗79A11（IgM）和69E29（IgG2a）,单抗79A11和69E2的特异性表位都是构象性表位,分别位于HPV16 E7蛋白二聚体的两个单体上。单抗79A11和69E2在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中定性检测天然的HPV16 E7蛋白具有潜在诊断价值。单抗79A11和69E2被应用于基于LSAB-鲁米诺-双抗夹心ELISA的化学发光免疫分析法中,定量检测HPV16 E7蛋白的定量限为18.9562 ng,该化学发光免疫分析法检测12例HPV16阳性的宫颈癌组织中HPV16 E7蛋白的检出率在100%,表明单抗79A11和69E2在化学发光免疫分析法定量检测天然的HPV16 E7蛋白具有潜在的诊断价值。
赵师贤[10]（2019）在《气液双信号肺癌标志物检测系统构建及性能研究》文中研究指明肺癌是发病率与致死率最高的恶性肿瘤之一。临床统计发现绝大多数患者直至肺癌晚期才被确诊,这也是其死亡率居高不下的主要原因之一,而早发现早治疗对于提高患者生存率有极大的帮助,因此对患者大规模的早期肺癌筛查与诊断具有重要意义。研究发现患者呼出气体中的挥发性有机物（Volatile Organic Compounds）的种类与含量异于正常人群,且与肺癌病灶组织有密切关系,已被众多研究人员作为肺癌气体标志物。与此同时血液与组织中的肺癌肿瘤标志物,如癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen）、细胞角蛋白19片段（CYFRA21-1）等有望应用于临床肺癌诊断。相比于医学影像学与穿刺活检,肺癌气液标志物的检测具有低成本、无创、快速等优点,虽然具有一定的假阳性率,但总体可用于大规模人群的早期肺癌筛查。然而目前对呼出气体检测多以大型仪器如气相色谱-质谱联用作为金标准,肿瘤标志物多采用酶联免疫吸附实验检测,其设备昂贵,操作复杂,往往离不开专业实验室,更不便于即时便携检测（Point of Care Testing）。虽然一些针对性的光电传感器,生物DNA传感器具有广谱性强,灵敏度高,特异性好等优点,但这些传感器往往因为信号成分单一（只有电信号,可见光信号,或者荧光信号等其中一个）,以及体系单一（气体或液体）,导致检测结果误判度较高。因此本文立足于实现肺癌患者筛查,综合分析现有筛查技术的不足,提出一套基于双信号双体系的新型肺癌标志物筛查检测系统,对肺癌呼出气体以及肿瘤标志物进行联合、快速、定性与定量检测,同时建立一套双信号特征提取算法以配合系统检测,为肺癌早期筛查提供新的思路。本文主要完成了以下几方面的工作:1)构建一套完整的新型双信号双体系肺癌标志物检测系统首先从交叉响应与特异性靶向识别机制出发,根据功能型需求分析构建检测系统,并以模块化思想为指导规划出气、液、光、机、电五大子系统,同时解决构建系统时所涉及到的五大关键性技术难题。在建立子系统时,涉及到传感气室的设计,气液传感阵列的设计,气路设计,光源设计等,并通过3D结构建模,数字模型仿真,流体力学分析、分时复用、数学模型计算、误差评估等多种数学工具与技术手段验证设计的可靠性以及配置其最优化参数,以完成系统集成。最后,将各个子系统有机整合,配合编写上下位机软件程序完成系统的调试,为后面双信号特征提取算法的设计以及气液标志物的检测提供依托平台。2)提出一套可见光信号特征提取算法从特征提取理论出发,分析可见光信号产生机制及其信号特点,在此基础上,通过信号预处理、形态学图像滤波、基于网格划分的图像分割、传感点颜色信息的提取与编码,以及最后的色彩空间转换,获取了标志物的“指纹图谱”以及HSI特征数据矩阵,为后续模式识别与计量分析提供基础。3)提出一套荧光信号特征提取算法对于荧光信号,同样根据特征提取思想,分析荧光信号产生机制与信号特点,运用光谱预处理、时频域特征提取、小波分析与分形维度等理论提取其荧光差谱的宏观与局部微观特征,并进行荧光差谱特征编码,以此算法获取的特征与数据可用于后续模式识别与计量分析。4)以交叉响应与特异性识别机制对肺癌气液标志物检测,以测试所构建的系统与算法性能。对于气体标志物,根据传感器双信号特点以及获取的数据特征矩阵,采用层次聚类分析（Hierarchical cluster analysis）,BP神经网络（Back-propagation）,主成分分析（Principal component analysis）等模式识别理论对目标气体进行了定性与定量分析,得到标志物对应的“指纹图谱”与“指纹光谱”,其中,对模式识别分析时出现的误判结果以及两种信号结果的比较分析,确定了以可见光信号进行定性以荧光信号进行定量的思路。同时分析误判来源,以设计新型传感阵列实现对醛类的检测;对于液体标志物,则采用适配体技术,结合Ag纳米团簇构建荧光探针,配合氧化石墨烯组成“荧光开断”体系以实现对液体标志物的定性与定量。最后通过大量实验测试,得到对肺癌标志性气体100%的定性识别率,以及低浓度下半定量区间（50ppb,200ppb,350ppb,500ppb）划分,整体区间划分误差小于10%;对醛类的100%准确识别以及对甲醛低浓度下具有40ppb3ppm的线性范围,最低检测限达到10.2ppb,以及91.2%110.4%较好的系统回收率;对CEA检测,探针具有靶向识别特异性,得到5.3 ng/ml14.7μg/ml的线性范围以及4.72ng/ml的检测限,综合验证了检测系统与算法的可行性。有望为临床筛查诊断提供新方法与新设备。
二、TTV DNA 定量检测系统之开发与临床应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、TTV DNA 定量检测系统之开发与临床应用（论文提纲范文）
（1）高通量细菌药敏检测仪器的研制及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 药敏试验标准的制定与发展 |
| 1.1 EUCAST与CLSI药敏试验标准的主要差异 |
| 1.2 药敏试验标准的发展趋势 |
| 第二章 细菌药物敏感检测方法研究进展 |
| 2.1 常规传统药敏试验方法 |
| 2.2 自动药敏检测系统 |
| 2.3 新型药敏试验技术 |
| 2.4 展望 |
| 第三章 药物敏感试验高通量检测技术研究进展 |
| 3.1 药敏试验检测技术及仪器的研制使用现状 |
| 3.2 高通量药物敏感试验检测技术的研制和进展 |
| 3.3 存在的问题和研究方向 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 高通量药敏试验接种仪的研制 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 便携式细菌培养箱的研制 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 药敏试验图像采集转换仪的研制 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 优化集成的高通量细菌药敏检测系统的临床应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间的科研成果 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 附件1:96点阵药敏计算机采集系统v1.0使用说明书 |
| 附件2 |
（2）以microRNA为靶标的CRISPR-Cas12a体外诊断技术及肿瘤诊疗一体化纳米探针的构建（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1 miRNA体外诊断技术概述 |
| 2 miRNA的等温扩增技术 |
| 2.1 滚环扩增技术 |
| 2.2 环介导的等温扩增技术 |
| 2.3 指数扩增技术 |
| 3 基于CRISPR-Cas12a系统的核酸检测技术 |
| 3.1 以DNA为靶标的CRISPR-Cas12a检测系统 |
| 3.2 以RNA为靶标的CRISPR-Cas12a检测系统 |
| 4 细胞内miRNA的荧光成像技术 |
| 4.1 基于有机荧光染料的细胞内miRNA荧光成像技术 |
| 4.2 基于上转换纳米颗粒的细胞内miRNA荧光成像技术 |
| 5 基于DNA功能化多孔纳米材料的刺激响应型药物递送系统 |
| 5.1 pH响应的DNA门控系统 |
| 5.2 G-四链体介导的DNA门控系统 |
| 5.3 适配体介导的DNA门控系统 |
| 5.4 酶介导的DNA门控系统 |
| 5.5 链置换反应介导的DNA门控系统 |
| 6 论文的研究思路及主要内容 |
| 第二章 基于DSN酶介导的放大策略及CRISPR-Cas12a的miRNA多重检测方法 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与耗材 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 激活序列TS长度的优化 |
| 3.2 CRISPR-Cas12a荧光放大系统的性能验证 |
| 3.3 DSN酶介导的miRNA循环放大系统的构建 |
| 3.4 基于CRISPR-Cas12a系统检测方法的性能评价 |
| 4 小结 |
| 第三章 基于切口引物介导的双重链置换扩增技术及CRISPR-Cas12a系统的miRNA检测新方法 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与耗材 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 双重链置换扩增反应中温度的优化 |
| 3.2 双重链置换扩增反应中时间的优化 |
| 3.3 引物固定区Tm值的优化 |
| 3.4 双重链置换扩增反应中引物浓度的优化 |
| 3.5 双重链置换扩增反应中聚合酶浓度的优化 |
| 3.6 双重链置换扩增反应中切口酶浓度的优化 |
| 3.7 检测方法的性能验证 |
| 3.8 方法学比对 |
| 4 小结 |
| 第四章 基于DNA功能化的上转换诊疗探针用于肿瘤细胞中miRNA的荧光成像及药物的靶向递送 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与耗材 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 UCNP@UIO-66-NH_2核壳复合物的结构表征 |
| 3.2 上转换纳米探针的表征 |
| 3.3 上转换纳米探针的药物响应性释放性能评价 |
| 3.4 上转换纳米探针检测分析性能评价 |
| 3.5 细胞内miRNA的上转换荧光成像 |
| 3.6 细胞内miRNA响应的药物特异性释放 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 MicroRNA体外检测及细胞原位成像技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参与的科研项目 |
（3）数字PCR微流控芯片的一体化及多重化方法的开发及应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 基于微流控系统的核酸提取 |
| 1.1.1 磁珠法核酸提取 |
| 1.1.2 二氧化硅原位提取 |
| 1.1.3 纸基核酸提取 |
| 1.1.4 其它核酸提取方法 |
| 1.2 基于微流控芯片的核酸扩增 |
| 1.2.1 数字PCR |
| 1.2.2 环介导等温核酸扩增 |
| 1.2.3 重组聚合酶扩增 |
| 1.3 多功能集成式微流控芯片 |
| 1.3.1 样品进-结果出式芯片 |
| 1.3.2 样品进-数字式-结果出式芯片 |
| 1.4 本论文的研究意义与研究内容 |
| 1.4.1 研究意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 2 一种用于集成数字PCR芯片的快速核酸提取系统 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PNE系统的组成及验证 |
| 2.3.2 数字PCR芯片的加工 |
| 2.3.3 PNE系统与数字PCR芯片集成 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 PNE系统的装载及提取过程 |
| 2.4.2 PNE系统核酸提取的回收率及完整性 |
| 2.4.3 PNE系统在细胞及血液中的核酸提取效果 |
| 2.4.4 集成芯片式数字PCR芯片 |
| 2.4.5 集成液滴数字PCR芯片 |
| 2.5 小结 |
| 3 一体化多重数字RPA检测系统用于病原菌的快速检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验仪器与装置 |
| 3.2.2 实验耗材与试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 芯片设计与加工 |
| 3.3.2 芯片中反应组分冻干 |
| 3.3.3 核酸提取与数字RPA |
| 3.3.4 细菌检测及结果读取 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 芯片的工作流程及结构 |
| 3.4.2 核酸提取 |
| 3.4.3 多重数字RPA |
| 3.5 小结 |
| 4 新型多重数字PCR芯片的研制及在肺癌EGFR突变位点中的应用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验仪器与装置 |
| 4.2.2 实验耗材与试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 芯片的设计与加工 |
| 4.3.2 多重数字PCR芯片操作 |
| 4.3.3 循环肿瘤DNA提取 |
| 4.3.4 数字PCR及数据分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 多重数字PCR芯片的设计与测试 |
| 4.4.2 反应组分预包埋 |
| 4.4.3 样品引入 |
| 4.4.4 芯片定量能力及实时检测 |
| 4.4.5 多重检测EGFR突变 |
| 4.4.6 临床样本测试 |
| 4.5 小结 |
| 5 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士期间成果 |
（4）基于不同微流控体系的实时PCR装置光电检测系统研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 微流控技术的发展与应用 |
| 1.2.1 微流控技术发展概述 |
| 1.2.2 微流控技术的应用 |
| 1.3 PCR技术的发展 |
| 1.3.1 数字PCR分类 |
| 1.3.2 数字PCR应用 |
| 1.4 研究内容 |
| 第2章 方法分析与元件选择 |
| 2.1 PCR芯片产物检测方法 |
| 2.2 荧光检测光路 |
| 2.2.1 正交型 |
| 2.2.2 非共焦型 |
| 2.2.3 共聚焦型 |
| 2.2.4 平行型 |
| 2.3 常见荧光检测系统 |
| 2.3.1 以发光二极管为激发光源的荧光检测系统 |
| 2.3.2 采用激光为激发光源的荧光检测系统 |
| 2.3.3 其他荧光检测系统 |
| 2.4 激发光源选择 |
| 2.5 光路选择 |
| 2.6 滤光片选择 |
| 2.7 成像传感器选择 |
| 第3章 系统搭建与实验准备 |
| 3.1 基于硅片与小型加热器的实时荧光定量PCR荧光检测系统设计 |
| 3.1.1 温度循环系统搭建 |
| 3.1.2 使用不同品牌的相机和智能手机进行荧光成像。 |
| 3.1.3 自动光反馈脚本设计 |
| 3.1.3.1 根据监控屏幕内单个像素点颜色变化进行拍照 |
| 3.1.3.2 使用按键精灵实时对比图像变化进行拍照 |
| 3.2 基于单一恒温热源的3D连续流动式数字PCR荧光检测系统设计 |
| 3.2.1 温度循环系统搭建 |
| 3.2.1.1 基于单螺旋3D微流控芯片的数字PCR装置 |
| 3.2.1.2 基于双螺旋3D微流控芯片的数字PCR装置 |
| 3.2.2 荧光检测系统搭建 |
| 3.3 基于微孔式d PCR芯片的数字PCR荧光检测系统设计 |
| 3.3.1 温度循环系统搭建 |
| 3.3.2 荧光检测系统搭建 |
| 3.4 实验试剂制备 |
| 3.4.1 实时荧光定量PCR系统检测试剂 |
| 3.4.2 数字PCR系统检测试剂 |
| 3.5 熔解曲线分析 |
| 3.6 数字PCR浓度计算 |
| 第4章 实验结果分析 |
| 4.1 基于硅片与小型加热器的实时荧光定量PCR系统验证 |
| 4.2 基于单一恒温热源的连续流动式数字PCR系统验证 |
| 4.2.1 基于单螺旋微流控芯片的数字PCR系统验证 |
| 4.2.2 基于双螺旋微流控芯片的数字PCR系统验证 |
| 4.3 基于微孔式d PCR芯片的数字PCR系统验证 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）微流控数字等温扩增技术研究及其在肝癌miRNA检测的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 肝癌早期诊断现状 |
| 1.1.2 肝癌miRNA分子标志物检测及应用 |
| 1.1.3 MiRNA检测技术进展 |
| 1.1.4 数字核酸扩增检测技术发展和应用 |
| 1.1.5 微流控数字等温扩增技术 |
| 1.2 研究意义 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 技术路线 |
| 1.5 拟解决的关键问题 |
| 1.6 可行性分析 |
| 1.7 本章小结 |
| 第2章 用于miRNA快速检测的链置换等温扩增技术研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 主要试剂和材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 无背景荧光探针链置换扩增(BF-ESDA)系统的构建 |
| 2.2.2.2 BF-ESDA实时荧光定量分析 |
| 2.2.2.3 真实样本试验 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 检测原理 |
| 2.3.2 新型无背景荧光探针设计 |
| 2.3.3 BF-ESDA方法的验证 |
| 2.3.4 BF-ESDA最适反应体系的优化和建立 |
| 2.3.4.1 探针最适浓度优化 |
| 2.3.4.2 Vent (exo-) DNA聚合酶和Nt.BstNBI切刻内切酶最适浓度优化 |
| 2.3.4.3 最适反应温度优化 |
| 2.3.5 BF-ESDA在单样本多靶标检测性能的分析 |
| 2.3.6 BF-ESDA检测灵敏度分析 |
| 2.3.7 BF-ESDA检测特异性分析 |
| 2.3.8 真实样本试验 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 miRNA绝对定量的微流控数字链置换等温扩增检测系统研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 主要试剂和配置方案 |
| 3.2.2 仪器与设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.3.1 自吸分液式高通量芯片制备 |
| 3.2.3.2 数字等温扩增反应体系的配置 |
| 3.2.3.3 芯片注样与油封 |
| 3.2.3.4 数字等温扩增检测和分析 |
| 3.2.3.5 数据分析 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 自吸分液式高通量微流控芯片设计与制备 |
| 3.3.2 芯片进样与油封试验 |
| 3.3.3 芯片防蒸发密封试验 |
| 3.3.4 芯片分液均一性试验 |
| 3.3.5 油液热稳定性试验 |
| 3.3.6 生物兼容性试验 |
| 3.3.7 微反应单元阴阳性结果的界定 |
| 3.3.8 定量准确性和检测灵敏度试验 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 肝癌相关miRNA分子标志物筛选和鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 研究对象 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.3.1 miRNA目标分子筛选与鉴定方案 |
| 4.2.3.2 临床样本收集和处理 |
| 4.2.3.3 总RNA提取、反转录及定量分析 |
| 4.2.3.4 数据分析 |
| 4.2.3.5 基因稳定性分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 肝癌miRNA相关分子的筛选 |
| 4.3.2 候选miRNA目标分子的定量分析 |
| 4.3.3 潜在miRNA分子标志物和内参基因的验证 |
| 4.3.4 肝癌miRNA分子标志物的诊断效能评价 |
| 4.3.5 hsa-miR-4644稳定性分析 |
| 4.3.5.1 RT-qPCR定量分析 |
| 4.3.5.2 软件分析和评价 |
| 4.3.6 单内参基因与双内参基因组合的性能对比 |
| 4.3.7 单内参基因与双内参基因组合的稳定性验证 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 肝癌早期诊断模型的建立及应用评价 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 主要试剂和仪器 |
| 5.2.2 研究对象 |
| 5.2.3 研究方案 |
| 5.2.4 实验方法 |
| 5.2.4.1 临床样本收集和处理 |
| 5.2.4.2 总RNA提取与质量检测 |
| 5.2.4.3 微流控数字等温扩增试验 |
| 5.2.4.4 肝癌miRNA标志物诊断效能评价 |
| 5.2.4.5 数据处理与分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 肝癌miRNA分子标志物表达水平分析 |
| 5.3.2 miRNA分子标志物、AFP及其组合诊断效能分析 |
| 5.3.3 肝癌早期诊断模型的建立 |
| 5.3.4 肝癌早期诊断模型的临床验证 |
| 5.4 本章小结 |
| 第6章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 第7章 创新点与不足 |
| 7.1 创新点 |
| 7.2 存在的不足 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（6）基于3D打印及智能手机的多能iPOCT检测平台的构建及其在DNA和生化标志物检测中的应用（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 超便携、多功能DNA智能即时检测平台的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 DNA智能即时检测平台的临床应用性能评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 生化标志物智能即时定量检测平台的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 生化标志物智能即时定量检测平台的临床应用性能评价 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 微纳技术在下一代即时检测中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（7）基于BD光盘纠错原理的嵌入式定量检测系统与仪器的研发（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 光盘光驱检测技术的研究现状 |
| 1.2.2 嵌入式系统发展现状及趋势 |
| 1.3 本文研究内容 |
| 第二章 嵌入式定量检测系统的总体方案设计 |
| 2.1 基于BD纠错的分子检测原理概述 |
| 2.1.1 光盘/光驱的物理格式和工作原理 |
| 2.1.2 蓝光光盘数据纠错与检测原理 |
| 2.2 嵌入式系统概述 |
| 2.2.1 嵌入式处理器与ARM |
| 2.2.2 嵌入式操作系统与嵌入式Linux |
| 2.3 需求分析与系统方案设计 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 嵌入式定量检测系统及仪器的实现 |
| 3.1 嵌入式开发平台搭建 |
| 3.1.1 硬件平台搭建 |
| 3.1.2 软件开发平台搭建 |
| 3.2 嵌入式系统软件的开发移植 |
| 3.2.1 Bootloader移植 |
| 3.2.2 Linux内核移植 |
| 3.2.3 根文件系统的构建 |
| 3.2.4 驱动程序开发移植 |
| 3.3 检测系统的应用软件开发 |
| 3.3.1 QT环境搭建 |
| 3.3.2 QPx Tool修改移植 |
| 3.3.3 数据处理程序开发 |
| 3.3.4 应用程序界面设计 |
| 3.4 嵌入式检测仪器的集成 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于嵌入式定量检测系统的实验检测 |
| 4.1 实验仪器与试剂 |
| 4.2 嵌入式定量检测系统可行性分析实验 |
| 4.2.1 墨点阵列光盘的制备与读取 |
| 4.2.2 可行性分析 |
| 4.3 BD表面生物素-链霉亲和素反应的定量检测 |
| 4.3.1 生物光盘的制备 |
| 4.3.2 实验结果与系统验证 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）抗肿瘤药物与贝类毒素检测的3D细胞与分子传感器的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗肿瘤药物筛选的概述 |
| 1.1.1 传统的药物开发流程 |
| 1.1.2 常见的药物筛选模型 |
| 1.1.3 细胞传感器在药物筛选中的研究现状 |
| 1.2 贝类毒素检测的概述 |
| 1.2.1 常见的贝类毒素 |
| 1.2.2 贝类毒素的检测手段 |
| 1.2.3 分子传感器在贝类毒素检测方面的研究现状 |
| 1.3 本文主要研究内容 |
| 第二章 3D细胞阻抗传感器系统设计及实验分析 |
| 2.1 3D细胞传感的背景和意义 |
| 2.2 3D细胞阻抗传感器的检测原理 |
| 2.2.1 3D细胞阻抗传感器的等效电路模型 |
| 2.2.2 3D细胞阻抗传感器等效电路的仿真验证 |
| 2.3 3D细胞阻抗传感器系统设计 |
| 2.3.1 3D细胞阻抗传感器芯片的设计与加工 |
| 2.3.2 3D细胞阻抗检测系统的设计 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 3D细胞培养 |
| 2.4.2 抗肿瘤药物干预 |
| 2.4.3 阻抗测量与数据分析 |
| 2.4.4 3D细胞荧光染色 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 3D细胞阻抗传感器的优化 |
| 2.5.2 3D细胞生长状态的实时监测 |
| 2.5.3 3D细胞阻抗传感器对抗肿瘤药物疗效的动态监测 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 3D微腔阻抗传感器设计及在抗肿瘤药物筛选中的应用 |
| 3.1 抗肿瘤药物筛选的背景和意义 |
| 3.2 3D微腔阻抗传感器的检测原理 |
| 3.3 3D微腔阻抗传感器的构建 |
| 3.3.1 3D微腔阻抗传感器芯片的设计与加工 |
| 3.3.2 3D微腔阻抗传感器的测试与优化 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 3D肺癌模型建立 |
| 3.4.2 肺癌药物干预 |
| 3.4.3 阻抗测量与数据分析 |
| 3.4.4 3D肺癌模型表征及图像三维重建 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 3D肺癌细胞活性的动态监测 |
| 3.5.2 MGIS芯片对顺铂疗效的动态监测 |
| 3.5.3 MGIS芯片对肺癌联合用药疗效的动态监测 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 结合便携式流式细胞仪的磁珠免疫传感器检测贝类毒素的研究 |
| 4.1 贝类毒素检测的背景和意义 |
| 4.2 磁珠免疫传感器结合流式细胞仪的检测原理 |
| 4.2.1 磁珠免疫传感器的设计 |
| 4.2.2 流式细胞仪的结构和检测原理 |
| 4.3 磁珠免疫传感器在贝类毒素检测方法的研究 |
| 4.3.1 实验试剂与耗材 |
| 4.3.2 生物素化OA的合成 |
| 4.3.3 免疫磁珠合成 |
| 4.3.4 磁珠免疫传感器测试 |
| 4.3.5 磁珠ELISA酶标仪测试 |
| 4.3.6 贝肉实际样品前处理与加标OA样本的制备 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 免疫磁珠的合成与优化 |
| 4.4.2 传感器检测OA的结果分析 |
| 4.4.3 传感器的特异性分析 |
| 4.4.4 传感器的稳定性分析 |
| 4.4.5 实际贝肉样品加标检测结果 |
| 4.4.6 传感器用于OA现场快速检测的讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 基于纳米金放大原理的适配体传感器在贝类毒素检测中的研究 |
| 5.1 适配体传感器的背景和意义 |
| 5.2 适配体传感器检测OA毒素的原理 |
| 5.3 实验部分 |
| 5.3.1 实验试剂和耗材 |
| 5.3.2 纳米金颗粒制备 |
| 5.3.3 适配体传感器构建 |
| 5.3.4 腹泻性毒素检测 |
| 5.4 实验结果与分析 |
| 5.4.1 传感器硅烷化表征 |
| 5.4.2 纳米金颗粒修饰结果 |
| 5.4.3 纳米金颗粒生长表征 |
| 5.4.4 传感器用于OA的测定结果 |
| 5.4.5 加标回收率结果分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 主要名词缩写 |
| 作者简历 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及科研成果 |
（9）HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备、表征及其诊断应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 基于人乳头瘤病毒的免疫诊断和免疫疗法用于HPV诱发癌症的研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 基于HPV的免疫诊断 |
| 1.2.1 检测肿瘤组织和细胞中的HPV蛋白抗原 |
| 1.2.2 检测患者唾液或阴道冲洗液中的抗HPV蛋白抗体 |
| 1.2.3 检测患者血清中抗HPV抗体 |
| 1.3 基于HPV的免疫治疗 |
| 1.3.1 用于治疗的天然抗HPV蛋白单克隆抗体 |
| 1.3.2 用于治疗的基于HPV蛋白mAb的放射免疫疗法 |
| 1.3.3 用于治疗的亲和毒素 |
| 1.3.4 用于治疗的HPV细胞内单链抗体(scFvs) |
| 1.3.5 用于治疗的HPV纳米抗体 |
| 1.3.6 治疗性疫苗接种 |
| 1.4 结论和展望 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景及目的意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.2.1 HPV16E7蛋白的制备 |
| 2.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备 |
| 2.2.3 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征 |
| 2.2.4 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在免疫化学、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用 |
| 2.2.5 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在常规双抗夹心ELISA中定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
| 2.2.6 HPV16 E7 蛋白单克隆抗体在化学发光免疫分析方法中定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
| 2.3 技术总路线 |
| 第3章 HPV16 E7 基因的克隆、表达及HPV16 E7 蛋白的纯化 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 重组质粒p ET-28a(+)-HPV16 E7 的构建 |
| 3.2.2 HPV16E7蛋白的诱导表达 |
| 3.2.3 HPV16E7蛋白的表达形式和镍柱纯化 |
| 3.2.4 HPV16 E7 蛋白的DEAE柱纯化及其二级结构的测定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 HPV16E7基因的克隆、鉴定 |
| 3.3.2 HPV16E7蛋白的表达和纯化 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备和纯化 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的制备、收集和保存 |
| 4.2.3 二步法纯化Ig G2a亚型的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体单抗69E2 |
| 4.2.4 二步法-辛酸-硫酸铵沉淀加Protein A的方案纯化Ig M亚型单抗69A6 |
| 4.2.5 四步法-硫酸铵沉淀+凝胶过滤层析+IgM柱+凝胶过滤层析的方案纯化Ig M亚型单抗79A11 |
| 4.2.6 间接ELISA测定纯化后的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的效价 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 HPV16E7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立 |
| 4.3.2 阳性克隆杂交瘤细胞株的筛选方法的建立 |
| 4.3.3 饲养层细胞的制备 |
| 4.3.4 细胞融合 |
| 4.3.5 杂交瘤细胞株的HAT选择性培养 |
| 4.3.6 阳性克隆的筛选 |
| 4.3.7 克隆化 |
| 4.3.8 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的制备 |
| 4.3.9 HPV16E7蛋白单克隆抗体腹水的保存 |
| 4.3.10 Ig G2a和 Ig M亚型的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的纯化 |
| 4.3.11 ELISA检测纯化后的HPV16 E7 蛋白单克隆抗体的效价 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 8株HPV16E7蛋白单克隆抗体的配对 |
| 5.2.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的亚型和氨基酸序列测定 |
| 5.2.3 2株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11和69E2 的亲和力测定 |
| 5.2.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的表位鉴定 |
| 5.2.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的特异性表位的保守性分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 8株HPV16E7蛋白单克隆抗体的配对 |
| 5.3.2 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的核苷酸序列的测定和氨基酸序列的预测 |
| 5.3.3 2株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11和69E2 的亲和力测定 |
| 5.3.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 的表位比较 |
| 5.3.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2、69A6 的特异性表位的保守性分析 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 HPV16 E7 蛋白单抗在免疫组化、免疫荧光和Western Blot中的诊断应用 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 8株HPV16 E7 单克隆抗体与HIS-c-Myc蛋白的Western Blot反应 |
| 6.2.2 8株HPV16E7单克隆抗体在免疫细胞化学中的诊断应用 |
| 6.2.3 3株HPV16 E7 单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫组织化学中的诊断应用 |
| 6.2.4 3株HPV16 E7 单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在间接免疫荧光中的诊断应用 |
| 6.2.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6与Ca Ski和HeLa细胞的总蛋白的Western Blot反应 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 8株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体与HIS-c-Myc蛋白的Weastern Blot反应 |
| 6.3.2 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫细胞化学中的诊断应用 |
| 6.3.3 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在免疫组织化学中的诊断应用 |
| 6.3.4 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6 在间接免疫荧光中的诊断应用 |
| 6.3.5 3株HPV16 E7 蛋白单克隆抗体79A11、69E2和69A6在Western Blot中的诊断应用 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 定量检测HPV16 E7 蛋白的常规双抗夹心ELISA法的建立 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 间接ELISA检测捕获抗体79A11 和检测抗体69E2 的效价 |
| 7.2.2 直接ELISA检测偶联物HRP-69E2 的抗体效价 |
| 7.2.3 封闭条件的优化 |
| 7.2.4 双抗夹心ELISA的棋盘实验 |
| 7.2.5 抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体79A11反应时间的优化 |
| 7.2.6 抗原HPV16 E7 蛋白在ng~μg级以3 倍稀释法稀释时的线性关系 |
| 7.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng级以等比等差法稀释时的线性关系和定量限 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 单抗在化学发光免疫分析方法中定量检测HPV16E7蛋白的诊断应用 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 间接ELISA测定单抗79A11和69E2 的抗体效价 |
| 8.2.2 直接ELISA测定检测抗体偶联物Biotin-69E2 的抗体效价 |
| 8.2.3 化学发光免疫分析方法的原理 |
| 8.2.4 捕获抗体79A11 和检测抗体Biotin-69E2 的最适工作浓度优化 |
| 8.2.5 抗原HPV16E7蛋白与捕获抗体反应的时间优化 |
| 8.2.6 封闭条件的优化 |
| 8.2.7 抗原HPV16 E7 蛋白在ng级以等比等差法稀释 |
| 8.2.8 抗原HPV16 E7 蛋白在μg级以等比等差法稀释 |
| 8.2.9 抗原在ng~μg级以3倍法稀释 |
| 8.2.10 制备参考曲线和检测临床标本 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第9章 全文总结 |
| 9.1 HPV16E7蛋白的制备 |
| 9.2 HPV16E7蛋白单克隆抗体的制备 |
| 9.3 HPV16E7蛋白单克隆抗体的表征 |
| 9.4 3株单抗79A11、69E2和69A6 定性检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
| 9.5 2株单抗79A11和69E2 定量检测HPV16 E7 蛋白的诊断应用 |
| 论文创新点 |
| 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表文章及课题参研情况 |
| 致谢 |
（10）气液双信号肺癌标志物检测系统构建及性能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 肺癌危害与现状 |
| 1.1.2 肺癌常规诊断技术现状 |
| 1.2 肺癌标志物检测 |
| 1.2.1 肺癌呼出气体标志物检测 |
| 1.2.2 肺癌血清肿瘤标志物检测 |
| 1.3 本文的研究目的及主要研究内容 |
| 1.3.1 本文研究目的 |
| 1.3.2 本文主要研究内容 |
| 2 气液双信号检测系统的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 气液双信号检测系统总体方案设计 |
| 2.2.1 检测系统需求分析及关键技术问题研究 |
| 2.2.2 检测系统总体架构 |
| 2.3 气路传感子系统 |
| 2.3.1 基于交叉响应双信号传感阵列构建 |
| 2.3.2 气路循环设计 |
| 2.3.3 基于COMSOL软件的磁盘反应室结构优化设计 |
| 2.4 液路检测子系统 |
| 2.4.1 流体力学建模 |
| 2.4.2 芯片结构设计 |
| 2.5 光信号探测子系统 |
| 2.5.1 可见光模块设计 |
| 2.5.2 荧光模块设计 |
| 2.6 机械传动子系统 |
| 2.6.1 传动导轨设计 |
| 2.6.2 定位误差评估 |
| 2.7 电路控制子系统 |
| 2.7.1 硬件平台搭建 |
| 2.7.2 系统工作流程建立 |
| 2.8 小结 |
| 3 可见光信号特征提取算法的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 可见光信号预处理 |
| 3.3 基于形态学图像滤波操作 |
| 3.4 敏感点特征指标提取 |
| 3.4.1 基于投影的旋转网格划分 |
| 3.4.2 局部图像分割 |
| 3.4.3 图像分割算法评测 |
| 3.5 敏感点颜色信息提取与编码 |
| 3.5.1 敏感点中心与半径的确定 |
| 3.5.2 加权比例半径确定提取区域 |
| 3.5.3 颜色信息差值编码 |
| 3.6 色彩空间转换 |
| 3.7 小结 |
| 4 荧光信号特征提取算法的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 荧光信号理论与差值光谱 |
| 4.3 光谱信号预处理 |
| 4.4 宏观特征指标提取 |
| 4.5 荧光分形特征提取 |
| 4.6 微观特征指标提取 |
| 4.6.1 小波变换 |
| 4.6.2 信息熵 |
| 4.7 荧光光谱信号特征编码 |
| 4.8 小结 |
| 5 检测系统对气液体标志物识别性能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 模式识别 |
| 5.2.1 层次聚类分析 |
| 5.2.2 主成分分析 |
| 5.2.3 基于BP神经网络的特征向量识别 |
| 5.3 对气体标志物的检测 |
| 5.3.1 标志性VOCs选取与制备 |
| 5.3.2 对标志性VOCs的检测识别 |
| 5.4 对醛类的检测识别 |
| 5.5 对液体标志物的检测 |
| 5.6 小结 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.1.1 本文主要工作 |
| 6.1.2 本文主要创新点 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A.作者在攻读博士学位期间完成的科研论文 |
| B.作者在攻读博士学位期间参与的科研项目 |
| C.作者在攻读博士学位期间参加的学科竞赛 |
| D.学位论文数据集 |
| 致谢 |
四、TTV DNA 定量检测系统之开发与临床应用（论文参考文献）
- [1]高通量细菌药敏检测仪器的研制及应用[D]. 骆延波. 吉林大学, 2021(01)
- [2]以microRNA为靶标的CRISPR-Cas12a体外诊断技术及肿瘤诊疗一体化纳米探针的构建[D]. 左晨. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]数字PCR微流控芯片的一体化及多重化方法的开发及应用[D]. 尹居鑫. 浙江大学, 2021(01)
- [4]基于不同微流控体系的实时PCR装置光电检测系统研究[D]. 李彬. 中国科学院大学(中国科学院长春光学精密机械与物理研究所), 2021(03)
- [5]微流控数字等温扩增技术研究及其在肝癌miRNA检测的应用[D]. 赵俊. 中国科学技术大学, 2020
- [6]基于3D打印及智能手机的多能iPOCT检测平台的构建及其在DNA和生化标志物检测中的应用[D]. 徐欢. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [7]基于BD光盘纠错原理的嵌入式定量检测系统与仪器的研发[D]. 徐晓宇. 太原理工大学, 2020
- [8]抗肿瘤药物与贝类毒素检测的3D细胞与分子传感器的研究[D]. 潘宇祥. 浙江大学, 2020(01)
- [9]HPV16 E7蛋白单克隆抗体的制备、表征及其诊断应用[D]. 胡仁建. 西南大学, 2020(01)
- [10]气液双信号肺癌标志物检测系统构建及性能研究[D]. 赵师贤. 重庆大学, 2019
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