一、反义甲基转移酶基因片段增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导对肝癌细胞的作用（论文文献综述）
马路园[1]（2021）在《LINC13及ACTR分别调控氧化应激及糖酵解介导肝癌耐药的机制研究》文中研究指明肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）以下简称“肝癌”,占原发性肝癌85%-90%,到2025年估计全球年发病人数将超过100万例,是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因,严重威胁我国人民的生命和健康。超过60%肝癌患者诊断时已处于疾病中晚期,系统药物治疗是可以选择的最重要的治疗方法。然而药物抵抗是目前中晚期肝癌治疗面临的最突出、最棘手的问题,也是治疗失败最根本的原因。像许多其他癌症一样,肝癌亦具有高度异质性,即便患者具有相似疾病表型,也可能具有不同的分子分型,使得治疗反应不尽相同。在分子水平上对患者进行分层有助于制定个体化治疗方案,提高药物疗效,降低耐药率,改善患者预后。因此,迫切需要阐明肝癌耐药的分子机制,筛选可预测肝癌耐药的分子标记物,并寻找控制耐药的新靶点。奥沙利铂（oxaliplatin,OXA）和索拉非尼分别是目前肝癌系统化疗和靶向治疗最常用的一线药物。OXA属于第三代铂类药物,作为一种双功能烷基化剂,OXA可以共价结合DNA形成铂-DNA复合物,阻断DNA复制和转录,杀伤肿瘤细胞。已有研究报道,铂类药物的化学抗性是导致临床化疗效果欠佳的重要原因,而同一基因的不同改变可能会带来抗药性或增强的药物敏感性。基因水平可反映药物疗效,部分可作为预测药物治疗反应的生物标志物,根据目标基因设计针对肿瘤患者的个性化药物可为临床提供最有效的化疗药物。随着非编码RNA研究的深入,发现部分长链非编码RNA（Long non coding RNA,lnc RNA）在调控基因转录、翻译及功能方面具有重要作用,亦可作为重要分子辅助HCC的诊疗。因此,筛选OXA耐药相关lnc RNA,评估其在肝癌患者OXA化疗耐药中的作用机制具有重要临床意义。索拉非尼是第一个用于晚期肝癌系统治疗的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）类药物,也是目前系统治疗的一线靶向药物。目前,索拉非尼耐药已成为限制其临床应用的重要原因,也是晚期HCC治疗中的一个主要挑战。然而,索拉非尼耐药机制尚未明确,亟需探索索拉非尼耐药相关新分子及耐药机制,为临床控制索拉非尼耐药提供新方向。第一部分肝癌OXA耐药相关新分子LINC13及其临床意义目的:通过OXA耐药引起的HepG2细胞差异表达分子确定OXA耐药相关新分子,并探索其临床意义。方法:1.结合目前临床肝癌患者化疗过程中OXA高耐药率的现状,我们首先运用大剂量药物冲击法建立了OXA耐药（OXA resistance,OXA-R）HepG2细胞系,结合克隆形成实验、流式细胞术分析HepG2细胞发生OXA耐药后细胞增殖及凋亡率的变化。提取OXA敏感（OXA sensitive,OXA-S）及OXA-R细胞总RNA,进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-Seq）,重点分析OXA耐药引起差异的lnc RNAs。结合逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）初步确定与OXA耐药相关性最高的lnc RNA。2.筛选癌症基因组图谱（The cancer genome atlas,TCGA）数据中病理诊断为HCC的患者342例。运用数据库中HCC患者LINC13数据绘制ROC曲线,确定LINC13的cutoff值。将HCC肝癌患者分为LINC13高、低水平2组,统计2组患者临床病理特征（年龄、性别、Child-pugh分期、肿瘤大小、病理分期、临床分期、血管浸润及临床预后）,分析LINC13水平与肝癌患者临床病理特征及预后的关系。3.运用基因表达谱交互分析网站（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）分析364例肝癌患者LINC13水平与总生存期（Overall survival,OS）及无病生存期（Diesase free survival,DFS）的关系,并绘制Kaplan-Meier生存曲线。4.回顾性从中国人民解放军总医院、广州医科大学附属肿瘤医院收集肝癌患者的肿瘤组织样本共153例,包括接受OXA静脉化疗的82例和不含OXA静脉化疗的71例,均具有完善的预后信息。提取153例肝癌组织总RNA,通过RT-PCR检测LINC13水平;分析LINC13水平与患者预后（即无进展生存期Progression-free survival,PFS）的关系,绘制Kaplan-Meier生存曲线。肝癌的诊断需符合2019年《原发性肝癌诊治规范》中肝细胞癌的诊断标准,课题经过中国人民解放军总医院、广州医科大学附属肿瘤医院的伦理委员会批准。本课题的相关实验符合赫尔辛基宣言的要求,并得到河北医科大学第三医院伦理委员会的批准。5.根据OXA治疗效果,将接受OXA化疗的82例患者分为OXA-S组及OXA-R组,每组挑选10例肝癌组织蜡块进行荧光探针原位杂交（Fluorescent In Situ Hybridization,FISH）,检测OXA-S及OXA-R肝癌组织LINC13水平,分析LINC13与OXA耐药的关系。结果:1.筛选肝癌细胞OXA耐药相关新分子我们成功建立了OXA-R的HepG2细胞系（耐药指数为3.36）。在OXA刺激下,与OXA-S细胞相比,OXA-R细胞增殖能力较强（P<0.01）、凋亡率较低（P<0.01）。RNA-Seq结合RT-PCR证实,LINC13是OXA-R细胞上调最为明显的lnc RNA（P<0.01）。2.LINC13与肝癌预后的关系分析TCGA数据库中364例HCC患者数据发现,LINC13水平与肝癌大小、临床分期、血管浸润及预后有关（P<0.05）,并且是肝癌预后的独立危险因素（P=0.003）。运用GEPIA网站分析LINC13与肝癌预后关系发现,与低水平LINC13肝癌患者相比,高水平LINC13肝癌患者临床预后较差,表现在患者OS（P=1.3e-05）和DFS较短（P=0.003）。3.LINC13与不同化疗方案患者预后的关系回顾性收集82例接受OXA治疗的肝癌患者,统计发现高水平LINC13患者43例,低水平LINC13患者39例;71例接受不含OXA化疗方案的患者中,高水平LINC13患者48例,低水平LINC13患者23例。分析各组患者LINC13与PFS关系发现,在接受OXA静脉化疗的HCC患者中,与低水平LINC13的患者相比,高水平LINC13患者PFS较短（P=0.001）;在接受不含OXA静脉化疗的HCC患者中,LINC13水平与PFS无关（P=0.306）。4.OXA敏感及耐药肝癌组织LINC13水平荧光探针原位杂交检测10例OXA-S及10例OXA-R肝癌组织荧光探针法LINC13水平,发现与OXA-S患者相比,OXA-R患者肝癌组织LINC13水平较高（P<0.01）。结论:1.LINC13是肝癌OXA耐药相关的新分子。2.LINC13与肝癌进展有关,是肝癌患者预后的独立危险因素。第二部分LINC13调控SM1介导肝癌OXA耐药的可能机制目的:结合转录组测序数据分析OXA耐药相关基因富集所在的信号通路,进一步阐明LINC13调控的靶基因引起OXA耐药的可能机制。方法:1.根据RNA-Seq数据中差异m RNA分析OXA耐药相关的基因所在的信号通路,富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）探索LINC13水平与OXA耐药相关基因富集的关系;流式细胞术初步探索OXA-S和OXA-R细胞ROS水平。2.统计TCGA数据库中364例肝癌患者LINC13水平,及可能的耐药通路中已经报道与耐药发生有关的基因（SM1、KEAP1、NQO1、BLVRB及GPX2）的水平,分析LINC13与各抗氧化应激基因的相关性,确定与LINC13相关性最高的基因可能为LINC13的靶基因。3.初步确定抗氧化应激基因中与LINC13相关性最高的基因,结合GEPIA网站分析SM1与肝癌患者OS及DFS关系;同时应用RT-PCR检测153例肝癌组织SM1水平,分析SM1水平对接受OXA化疗的82例HCC患者及71例接受不含OXA化疗方案的患者PFS的影响;4.提取OXA-S和OXA-R的HepG2细胞总RNA及总蛋白,检测SM1转录及蛋白水平;免疫组织化学染色法检测10例OXA-S及10例OXA-R肝癌组织SM1的表达水平。5.提取LO2、HepG2、HCC-LM3、Hu H-7、Hep3B、MHCC97H细胞总RNA及总蛋白,分别检测LINC13转录水平及SM1蛋白水平并进行相关性分析;分析SM1与肝癌OXA耐药的关系。6.分子克隆技术构建LINC13及SM1重组质粒,通过细胞转染、RT-PCR、western blot分析LINC13对SM1靶向调控作用。CCK-8法检测HepG2、MHCC97H细胞在不同浓度OXA作用下的存活率,确定IC50。结果:1.OXA耐药相关通路及LINC13与可能耐药通路之间的关系根据RNA-Seq数据分析OXA耐药相关信号通路,发现抗氧化应激通路是OXA耐药相关基因主要富集的通路之一,且GSEA分析发现LINC13与抗氧化应激相关基因富集量正相关（P=0.006）。流式细胞术证实OXA耐药细胞较敏感细胞ROS水平低（P<0.01）。2.分析LINC13与抗氧化应激通路部分基因的相关性分析364例TCGA数据库中肝癌患者的基因表达量的相关性,证实LINC13与抗氧化应激相关通路中SM1、KEAP1、NQO1及GPX2正相关,其中LINC13与SM1相关性最高（P<0.0001,R=0.295）。3.SM1与肝癌患者预后及OXA治疗效果的关系结合GEPIA网站分析364例肝癌患者SM1水平与预后的关系,发现高水平SM1患者OS及DFS较短但无统计学意义;分析临床接受OXA静脉化疗的患者SM1水平与预后关系,发现与低水平SM1患者相比,高水平SM1患者PFS较短（p=0.007）;接受不含OXA静脉化疗的肝癌患者SM1水平对PFS无影响。4.SM1在OXA-S及OXA-R肝癌组织的表达水平与OXA-S的HepG2细胞相比,OXA-R细胞SM1转录及翻译水平较高（P<0.01）;与OXA-S肝癌组织相比,OXA-R肝癌组织SM1表达水平较高（P<0.01）。5.LINC13与SM1的关系及调控机制与肝脏LO2细胞相比,HCC细胞中LINC13转录水平及SM1蛋白水平较高,相关性分析发现LINC13转录水平与SM1蛋白水平呈显着正相关（R=0.972,P=0.0012）。与对照组相比,在HepG2细胞过表达LINC13后SM1水平明显升高,在MHCC97H细胞沉默LINC13后SM1水平明显降低（P<0.01）。CCK-8法测定HepG2细胞应用OXA的IC50为9.14μM,MHCC97H细胞应用OXA的IC50为14.87μM。结论:1.LINC13与抗氧化应激反应正相关,可能通过促进抗氧化应激反应导致OXA耐药。2.LINC13靶向调控SM1,可能通过抗氧化应激途径介导OXA耐药。第三部分肝癌细胞中LINC13调控SM1的分子机制目的:分析LINC13调控SM1及OXA在LINC13-SM1途径中的作用。方法:1.通过FISH技术观察LINC13在HepG2及MHCC97H的细胞定位,初步确定LINC13调控SM1发生在转录后翻译水平还是在转录水平。2.从NCBI网站查找SM1的启动子区域,通过PROMO、Gene Cards及UCSC网站联合预测SM1的转录因子,应用韦恩图取网站预测转录因子的交集。结合双荧光素酶报告基因实验检测转录因子（NRF2、STAT3、ATF3、KLF5、SF1）与LINC13共转染后对SM1启动子的激活作用,最终确定SF1为SM1的转录因子。3.根据JASPAR网站预测SF1与SM1结合的序列,继而构建SM1启动子及其突变体重组质粒。通过细胞转染技术、双荧光素酶报告基因实验确定LINC13及SF1对SM1的转录的影响及结合位置。4.双荧光素酶报告基因实验分析LINC13、OXA对SM1启动子的作用;通过Ch IP实验分析LINC13、OXA对SF1转录结合SM1的作用,阐明LINC13、OXA对SM1转录调控机制。5.将HepG2、MHCC97H两个细胞系分为对照组、转染LINC13组、加SF1抑制剂光辉霉素（Mithramycin A,MMA）组、转染LINC13后加MMA组,通过RT-PCR鉴定LINC13转染效率,通过Western blot分析SM1蛋白水平,分析LINC13调控SM1翻译的机制。6.选10例高LINC13水平及10例低LINC13水平的肝癌组织,并取对应的20例癌旁组织进行免疫组织化学染色和荧光探针原位杂交,检测LINC13、SM1、SP1在肝癌组织中的水平,分析LINC13水平与SM1及SF1在组织表达的相关性。结果:1.LINC13在肝癌细胞中的定位观察LINC13在HepG2及MHCC97H两个细胞系的定位,证实LINC13在细胞核及细胞质均有表达,但主要定位于细胞核。2.筛选SM1转录因子及结合启动子的可能位置PROMO、Gene Cards及UCSC网站联合预测发现SF1为SM1的转录因子。结合双荧光素酶报告基因实验证实,NRF2、STAT3、ATF3、KLF5、SF1转录因子中,在LINC13存在条件下SF1可明显提高SM1启动子活性;LINC13可显着提高SM1的启动子活性,转录因子SF1与SM1的结合位点在SM1启动子区域的第二段。3.LINC13、OXA可调控SM1启动子活性双荧光素酶报告基因实验证实LINC13、OXA可提高SM1的启动子活性;Ch IP实验进一步证实LINC13、OXA通过增强SF1募集到SM1启动子区域发挥转录调控SM1的作用。4.LINC13通过SF1调控SM1蛋白表达LINC13可促进SM1表达,MMA可抑制SM1表达,LINC13不可逆转MMA对SM1的抑制作用,证实LINC13通过SF1调控SM1表达。5.临床样本分析LINC13与SF1、SM1相关性肝癌蜡块组织中LINC13水平、SF1、SM1表达鉴定及相关性分析发现,高水平LICN13较低水平LINC13肝癌组织SF1、SM1表达较高,且肝癌组织LINC13、SF1、SM1的水平均显着高于癌旁组织。结论:1.LINC13在转录水平发挥调控SM1的作用。2.LINC13、OXA可通过增强SF募集到SM1启动子区域发挥转录调控作用。3.LINC13与SF1、SM1表达正相关,并且LINC13通过SF1调控SM1表达。第四部分LINC13-SF1-SM1轴促进抗氧化应激反应导致肝癌OXA耐药目的:探索LINC13-SF1-SM1轴调控HCC细胞活性氧及谷胱甘肽水平,分析氧化还原稳态在OXA耐药中的作用。方法:将HepG2细胞分为对照组,过表达LINC13组,过表达SF1组,SM1敲除（knockout,KO）细胞过表达LINC13组,SM1 KO细胞过表达SF1组;将MHCC97H细胞分为对照组,沉默LINC13组,沉默LINC13再回转SM1组。将HepG2细胞分为对照组,过表达LINC13组,加MMA组,过表达LINC13后加MMA组。运用过表达及敲低转染技术进行如上实验。各组细胞加入不同浓度OXA后通过CCK-8法检测细胞存活率;克隆形成实验检测细胞增殖情况;通过流式细胞术分析细胞活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平;谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物（glutathione/glutathione disulfide,GSH/GSSG）试剂盒检测细胞GSH/GSSG比率。结果:1.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞存活率的影响与对照组相比,沉默LINC13、MMA、敲除SM1均可增强OXA杀伤HCC细胞的作用（P<0.01）;过表达LINC13、SF1可减弱OXA对HepG2细胞的杀伤作用。回转SM1可逆转沉默LINC13后OXA对MHCC97H细胞的强杀伤作用;过表达SF1或LINC13不能逆转SM1 KO HepG2后OXA对细胞的杀伤作用;过表达LINC13后不能减弱MMA联合OXA对HepG2细胞杀伤作用。2.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞ROS水平的影响OXA可刺激HCC细胞ROS水平升高;与OXA组相比,过表达LINC13、SF1后可减弱OXA对细胞的刺激作用,ROS水平降低;沉默LINC13、加MMA或SM1 KO可增强OXA对细胞的刺激作用,ROS水平升高;SM1可逆转LINC13沉默的作用;而LINC13、SF1无法逆转SM1KO的作用;且LINC13无法逆转MMA的作用。（P<0.05）3.LINC13-SF1-SM1对OXA作用下肝癌细胞谷胱甘肽水平的影响OXA可降低HCC细胞GSH/GSSG比例;过表达LINC13、SF1后可减弱OXA对细胞的刺激作用,GSH/GSSG较OXA组升高;沉默LINC13、MMA或SM1 KO可增强OXA对细胞的刺激作用,GSH/GSSG较OXA组明显降低;SM1可逆转LINC13沉默的作用;而LINC13、SF1无法逆转SM1 KO的作用;且LINC13无法逆转MMA的作用。（P<0.05）结论:1.LINC13调节SF1-SM1途径,抑制OXA对HCC细胞杀伤作用。2.LINC13-SF1-SM1轴促进HCC细胞抗氧化应激反应导致OXA耐药。第五部分ACTR调控糖酵解作用介导肝癌索拉非尼耐药目的:筛选索拉非尼耐药相关新分子及其调控索拉非尼耐药的机制。方法:1.通过基因表达数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）筛选包含索拉非尼治疗敏感及耐药的肝癌RNA-Seq数据集;初步筛选索拉非尼耐药相关基因。在裸鼠接种索拉非尼敏感和耐药细胞,待形成异种移植瘤后提取肿瘤组织总RNA鉴定索拉非尼耐药相关基因水平,初步确定索拉非尼耐药相关新分子。2.结合TCGA数据库中364例HCC临床数据,分析ACTR水平与肝癌患者OS的关系,并在GEPIA网站分析ACTR与糖酵解基因（GLUT1、PKM2及LDHA）的相关性。3.将HepG2细胞分为对照组、加糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose,2-DG）组、敲除ACTR（ACTR KO）组、ACTR KO加2-DG组、ACTR KO细胞回转ACTR组、ACTR KO细胞加2-DG后再回转ACTR组;将Hu H-7细胞分为对照组、加2-DG组、沉默ACTR组、沉默ACTR后加2-DG组、沉默ACTR再回转ACTR组、沉默ACTR加2-DG再回转ACTR组;通过CCK-8法及克隆形成实验检测各组细胞存活及增殖情况;Seahorse XFe96仪检测细胞外酸化率（extracellular acidification rate,ECAR）和氧消耗率（oxygen consumption rate,OCR）水平。4.回顾性研究纳入初始未经任何治疗、具有肝癌组织样本的患者126例。患者来自中国人民解放军总医院,肝细胞癌的诊断需符合2019年《原发性肝癌诊治规范》的诊断标准,课题已经过中国人民解放军总医院及河北医科大学第三医院伦理委员会批准。对126例患者肝癌组织进行免疫组织化学染色,分析ACTR、LDHA及PKM2表达情况,并进行相关性分析。结合oncomine数据库进一步分析ACTR与部分糖酵解基因的相关性。结果:1.筛选索拉非尼耐药相关新分子从GEO数据库筛选出索拉非尼敏感和耐药异种移植瘤差异基因,发现ACTR在索拉非尼耐药异种移植瘤中明显上调,通过裸鼠成瘤实验分析敏感和耐药移植瘤中索拉非尼耐药基因差异表达情况,初步确定ACTR是索拉非尼耐药上调最明显的基因（P<0.01）。2.ACTR与肝癌患者预后及糖酵解基因的关系分析GEPIA网站中TCGA肝癌患者数据,364例患者中高水平ACTR患者182例,低水平ACTR患者182例。与低水平ACTR患者相比,高水平ACTR患者OS较短（P=0.024）。通过GEPIA网站数据进行相关性分析发现,ACTR与糖酵解基因GLUT1（R=0.32）、PKM2（R=0.38）、LDHA（R=0.40）呈显着正相关（P<0.0001）。3.ACTR-糖酵解途径对索拉非尼作用下细胞存活率及增殖的影响与对照组相比,沉默或敲除ACTR后Hu H-7及MHCC97H细胞生长减慢、增殖减弱,对索拉非尼的敏感性增强。2-DG可增强索拉非尼抗肿瘤作用。回转ACTR可逆转沉默或敲除ACTR增敏索拉非尼的作用,但不能逆转2-DG增敏索拉非尼的作用。4.ACTR-糖酵解途径对索拉非尼作用下细胞外酸化率（extracellular acidification rate,ECAR）及耗氧率（oxygen consumption rate,OCR）的影响与对照组相比,沉默ACTR、索拉非尼可抑制肝癌细胞ECAR水平,抑制糖酵解作用;沉默ACTR可增强索拉非尼抑制ECAR水平,增强抑制索拉非尼抑制糖酵解的作用;回转ACTR后可逆转这一作用,恢复糖酵解能力。与对照组相比,沉默ACTR、加索拉非尼可增强细胞有氧呼吸能力,表现在氧化磷酸化功能增强、耗氧率升高;回转ACTR后可逆转沉默ACTR的作用,减弱细胞有氧呼吸,降低氧化磷酸化水平及耗氧量。（P<0.01）5.临床样本分析ACTR与糖酵解基因的相关性对126例临床样本进行免疫组织化学染色证实,肝癌患者ACTR与LDHA、PKM2表达正相关或（P<0.01）;结合Oncomine网站分析基因相关性,证实ACTR与糖酵解相关基因GLUT1/PKM2/LHDA/PFKL/ENO1等均存在正相关（P<0.05）。结论:1.ACTR是索拉非尼耐药中显着上调的新分子,与糖酵解作用有关。2.ACTR通过调节糖酵解作用导致索拉非尼耐药。结论:1.LINC13是肝癌OXA耐药相关的新分子。2.LINC13调控SF1-SM1途径增强抗氧化应激反应导致OXA耐药。3.ACTR是肝癌索拉非尼耐药相关的新分子。4.ACTR通过调节糖酵解作用导致索拉非尼耐药。
樊潇霄[2]（2020）在《肝癌和癌栓的全基因组甲基化分析及差异基因的相关临床特征研究》文中研究表明背景和目的:原发性肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一类我国高发病率、高死亡率的恶性肿瘤,给我国人民健康造成了极大负担。门静脉癌栓（PVTT）是肝癌中一种常见的转移形式之一,给肝癌治疗带来极大的困难。DNA甲基化异常是肿瘤发生发展的关键机制之一,因其稳定且可以伴随疾病发展或治疗而变化,是一个潜在的理想生物标志物。本研究通过全DNA甲基化分析对门静脉癌栓特征进行分析,探索门静脉癌栓中可能存在的关键分子事件,并重点分析了DNAH17和ADRA1A两个基因在肝细胞肝癌中甲基化改变情况。实验方法:利用Infinium Human Methylation450芯片（病人数=11）对邻近正常组织（ANT）、HCC组织和PVTTs进行全基因组DNA甲基化分析。通过MTS实验和凋亡实验,以评估地西他滨（DAC）和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（rh-TRAIL）对肝癌细胞系抑制的协同作用。在对DNAH17的研究中,主要使用Sequenom Epi TYPER法评估了163个HCC样本及其配对正常组织中DNAH17的甲基化水平,并利用Taq Man拷贝数试剂盒分析来评估DNAH17在样本中的拷贝数状态。同时结合免疫组化、q PCR等验证该基因该肝癌中的表达差异。对ADRA1A的研究中,同样使用了Sequenom Epi TYPER对分析了160个HCC患者中该基因的甲基化水平。通过构建稳转细胞系、免疫组化、转录组测序等方法,探索该基因在肝脏中潜在作用机制。实验结果:1、HCC组织和PVTTs的整体平均甲基化水平明显低于ANT（P<0.01）。在HCC组织和配对的PVTTs之间共鉴定532个差异基因中864个差异甲基化Cp G位点（平均甲基化差异>10%,P<0.005）。基于PVTT组织中高甲基化基因的KEGG通路分析显着富集于肌动蛋白细胞骨架调控通路（P=4.48 E-5）。23个基因的甲基化水平在HCC和PVTT中呈梯度变化,其中17个基因的甲基化水平梯度升高（例如,PAK1、NDRG2、SLC9A3R2、ZC3H3）和6个基因梯度降低（ADORA2A、KIAA1143、NAPEPLD、PARVG、TNFRSF10A、TSTD1）。TNFRSF10A是TRAIL的关键细胞表面受体之一,可被rh-TRAIL激活。MTS实验和细胞凋亡实验表明,DAC和rh-TRAIL联合使用可协同抑制SK-Hep-1和Huh7细胞系的增殖以及诱导凋亡。2、与ANT相比,肝癌组织的DNAH17平均甲基化水平显着降低（扩增子1:58.7%vs.84.5%（癌vs.癌旁）,P<0.0001;扩增子2:69.9%vs.84.5%（癌vs.癌旁）,P=0.0060）。RNA-seq和免疫组化均显示肿瘤组织中DNAH17表达增加（P<0.05）。DNMT抑制剂处理肝癌细胞可发现DNAH17表达上调。DNAH17基因扩增常和低甲基化状态并存。还发现低甲基化状态与男性患者、较高的AFP值、高龄、存在完整包膜、存在肿瘤坏死、肝硬化、肝癌癌栓等临床特征相关（P<0.05）。ROC曲线分析显示,DNAH17的甲基化水平可以有效预测肝癌包膜（AUC=0.695）和肝癌癌栓（AUC=0.806）的存在。3、ADRA1A m RNA水平和蛋白水平在肝癌组织中的表达水平明显降低。与ANT相比,160例肝癌患者的肿瘤组织中ADRA1A启动子区域的平均甲基化水平显着升高（25.2%:17.0%,P<0.0001）。地西他滨作用肝癌细胞系,可以增加肝癌细胞系中ADRA1A的表达。此外,肝癌样本中ADRA1A基因的高甲基化水平与酒精摄入（P=0.0097）和甲胎蛋白（P=0.0411）存在明显相关性。ROC曲线分析显示,ADRA1A的平均甲基化水平可以区分HCC组织与癌旁非癌组织（AUC=0.700,P<0.0001）。通过构建ADRA1A稳定敲减的肝癌细胞系的转录组测序结果显示,主要富集途径为癌通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路和代谢通路（P<0.01）。结论:我们的研究表明,DNA甲基化通过调节转移相关的途径在PVTT的形成中发挥重要作用。DAC与rh-TRAIL联合应用可能是一种有前景的HCC治疗策略。DNAH17的异常甲基化与肝癌的多种临床病理特点有关,可能是肝癌患者肿瘤血栓形成的一个有潜在应用价值的生物标志物。ADRA1A基因异常高甲基化可能参与HCC的发生,同样有可能作为HCC诊断的生物标志物。
刘桂炎[3]（2020）在《LncRNA HOTAIR调控通路遗传变异与肝癌易感性关联研究》文中研究说明目的:原发性肝癌（Primary liver cancer,PLC）,简称肝癌,是全球最常见的恶性肿瘤之一,近年来我国新发肝癌人数约占全球肝癌新发总数的一半,并且肝癌患者预后差,生存率低,导致肝癌死亡率和发病率几近相同。最新研究表明肝癌在广东省恶性肿瘤新发病和死亡谱中分别排第4和第2顺位,其不断增加的发病率和死亡率给广东省带来沉重的疾病负担,是严重威胁居民健康和生命的恶性肿瘤。肝癌被认为是环境暴露与遗传因素共同作用的结果,HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA,HOTAIR）作为研究最多最热门的LncRNA之一,在人类恶性肿瘤中上调,与癌症的发生和转移呈正相关。HOTAIR具有复杂的生物学功能,基因遗传变异可以影响自身结构改变,影响转录和表达,从而干扰下游靶基因的功能,与下游靶基因的遗传变异共同促进肝癌发生发展。因此,本研究结合分子流行病学、分子生物学和生物信息学方法,探讨LncRNA HOTAIR调控通路遗传变异的单独作用,遗传变异-环境、遗传变异间交互和中介效应对肝癌发生的影响,并进一步探究HOTAIR调控通路遗传变异单独作用和遗传变异-环境交互作用对肝癌发展的影响。方法:采用频数匹配的病例-对照研究方法,在广东人群中系统分析LncRNA HOTAIR调控通路（HOTAIR-EZH2-TP53-PTEN）遗传变异对肝癌易感性影响。综合多个功能预测数据库和生物信息学工具,结合国内外参考文献和标签单核苷酸多态性（tag Single Nucleotide Polymorphism,tagSNP）方法筛选HOTAIR调控通路上具有潜在功能的遗传变异（HOTAIR:rs12427129、rs3816153;EZH2:rs887569、rs12670401、rs80052686、rs6950683;TP53:rs16427129;PTEN:rs2735343）,应用Taq Man实时荧光定量PCR技术对目标遗传变异进行基因分型;采用c2检验比较病例组和对照组中环境因素和基因型分布的差异;运用MAX方法筛选各基因遗传变异最佳遗传模型;采用单因素和多因素Logistic回归模型分析环境因素与遗传变异对肝癌发生发展的影响;进一步用错误发现率（False Discovery Rate,FDR）方法进行多重校正;采用单体型和遗传风险评分方法分析基因遗传变异累积效应对肝癌易感性影响;在传统Logistic回归中引入交互项计算相乘交互,使用Logistic回归结合Delta方法计算相加交互,探索遗传变异与环境因素、遗传变异之间对肝癌发生发展的两两交互作用;应用多因子降维（MDR）和分类回归树（CART）分析HOTAIR调控通路遗传变异间、遗传变异-环境因素高阶交互作用对肝癌易感性影响;运用四向分解法探讨环境因素在各基因遗传变异与肝癌关联中的交互效应和中介效应以及各成分的贡献率大小。结果:1.本研究共纳入1453例原发性肝癌病例和1646例健康对照。多因素Logistic回归分析结果显示,慢性HBV感染和肝癌发病风险有关,关联OR值（odd ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence interval,95%CI）为14.46（95%CI=12.08～17.65）;吸烟和饮酒也与肝癌的发病风险有关联（OR=2.76,95%CI=2.22～3.43;OR=2.27,95%CI=1.82～2.82）。2.HOTAIR基因rs12427129、rs3816153和PTEN基因rs2735343显性模型下与肝癌发病风险有关联。调整潜在混杂因素后,个体携带rs12427129 T等位基因与C等位基因相比降低肝癌发病风险（OR=0.64,95%CI=0.51～0.80,P<0.001）;与携带GG基因型相比,个体携带rs3816153GT+TT基因型会增加肝癌风险（OR=1.22,95%CI=1.01～1.46,P=0.039）,携带GC+CC基因型个体降低肝癌发病风险（OR=0.76,95%CI=0.61～0.94,P=0.012）。单体型分析结果显示,HOTAIR TG单体型携带者相比CG单体型降低肝癌发病风险（OR=0.24,95%CI=0.14～0.40,P<0.001）;相比携带EZH2 GCCT单体型,GTCC单体型携带者降低肝癌发病风险（OR=0.75,95%CI=0.65～0.89,P=0.001）。遗传风险评分结果表明,肝癌发病风险随着遗传风险评分等级增大而增加,其中6-7个风险评分等级风险最大（OR=3.12,95%CI=1.95～5.00,P<0.001）。3.遗传变异与环境因素、遗传变异间两两交互作用对肝癌发生分析结果显示,HOTAIR rs12427129与饮酒存在有统计学意义的相乘交互作用,与慢性HBV感染存在相乘相加交互作用;HOTAIR rs3816153与慢性HBV感染存在相加交互作用;PTEN rs2735343与癌症家族史之间存在相加交互作用,与慢性HBV感染存在相加交互作用（P值均小于0.05）;HOTAIR rs3816153与EZH2 rs80052686之间存在相乘和相加交互作用(Pmul=0.033,Padd=0.045),与EZH2 rs12670401之间存在临界统计学意义的相乘和相加交互(Pmul=0.072,Padd=0.074)。4.采用MDR分析遗传变异与环境因素、遗传变异间高阶交互作用对肝癌发生影响,遗传变异与环境因素MDR结果显示慢性HBV感染、HOTAIR rs12427129和rs3816153存在交互作用,该模型训练样本准确度为0.7939,验证样本准确度为0.7922,交叉检验一致性10/10,置换检验P<0.001;遗传变异间MDR结果最优模型EZH2 rs12670401、rs80052686和PTEN rs2735343,对应各项指标分别为0.5568、0.5434、10/10和P<0.001,提示3个遗传变异之间存在交互作用。5.采用CART分析遗传变异与环境因素、遗传变异间高阶交互作用对肝癌发生影响,遗传变异与环境因素CART分析显示慢性HBV感染、吸烟和PTEN rs2735343存在交互作用;遗传变异间CART分析结果显示HOTAIR rs12427129、EZH2 rs12670401和PTEN rs2735343之间存在交互作用。6.应用四向分解法分析遗传变异-环境因素、遗传变异间的中介效应,调整混在因素结果显示,HOTAIR rs12427129、rs3816153和PTEN rs2735343与慢性HBV感染对肝癌发生的效应主要归因于参考交互效应,超额相对危险度分别为0.91（95%CI=0.38～1.45,P=0.001）、-0.30（95%CI=-0.48～-0.11,P=0.002）和0.52（95%CI=-0.48～-0.11,P=0.037）;rs2735343与吸烟对肝癌的效应主要归因于参考交互作用,超额相对危险度为0.28（95%CI=-0.03～0.58,P=0.074）,贡献率为76.58%（P=0.008）;rs2735343和饮酒纯中介效应对肝癌影响有临界统计学意义（超额相对危险度=0.04,95%CI=-0.00～0.07,P=0.065）。7.EZH2 rs12670401隐性模型（CC vs TT+TC）会增加肝癌患者形成门静脉癌栓风险（OR=1.90,95CI=1.42～2.56,P<0.001）,rs12670401分别与吸烟和饮酒对门静脉癌栓形成存在相乘和相加交互作用（P值均小于0.001）;rs12670401与癌症家族史之间对门静脉癌栓形成存在有统计学意义相乘交互和临界统计学意义相加交互作用(Pmul=0.005;Padd=0.051)。rs12670401与吸烟对肝癌患者发展为TNM晚期风险存在有统计学意义相乘和相加交互作用（P均小于0.05）;rs12670401与饮酒之间对患者发展为TNM晚期风险存在有统计学意义相乘交互和临界统计学意义相加交互(Pmul=0.034;Padd=0.050)。结论:本研究通过遗传关联性分析发现HOTAIR调控通路遗传变异rs12427129、rs3816153和rs2735343与肝癌发生密切相关。慢性HBV感染分别与HOTAIR rs12427129、rs3816153和PTEN rs2735343,饮酒与rs12427129,癌症家族史与rs2735343之间存在的两两交互作用会影响肝癌的发生。分析影响肝癌发生的遗传因素交互时,除发现HOTAIR rs3816153分别与EZH2 rs12670401、rs80052686存在两两交互外,本研究还发现EZH2 rs12670401、rs80052686和PTEN rs2735343;HOTAIR rs12427129、EZH2 rs12670401和PTEN rs2735343之间存在高阶交互,其复杂的交互作用影响肝癌的易感性。进一步研究发现EZH2 rs12670401遗传变异及其与环境因素（吸烟、饮酒和癌症家族史）交互效应影响肝癌预后（TNM分期和门静脉癌栓）。本研究结果可为进一步肝癌发病机制提供新的思路和理论基础,对寻找肝癌潜在的治疗靶点提供参考方向,但本研究发现遗传变异与肝癌关联仅限于统计层面,进一步通过生物信息学功能预测HOTAIR-EZH2-TP53-PTEN影响肝癌发生发展潜在的生物学机制,该结果仍需要进一步分子生物学功能实验验证。
邵世怡[4]（2020）在《肿瘤响应纳米药物构建及个体化miRNA鸡尾酒疗法治疗肝癌》文中指出研究背景:原发性肝癌起病隐匿,恶性程度高,尤其是中晚期确诊的患者,多为不可切除性肝癌,现有系统性治疗药物疗效局限,难以显着改善患者临床结局。因此,亟需探索新型肝癌药物治疗策略。mi RNA失调是肝癌发生发展的重要机制。mi RNA替代疗法可改善肝癌内mi RNA表达谱,已成为新兴的肝癌治疗策略,但受限于mi RNA的不稳定性和脱靶效应,实际治疗效果不佳。纳米药物输送体系是近年来肿瘤治疗研究的热点之一,开发新型mi RNA载体、实现体内靶向递送和精准控释,有望解决mi RNA应用难题。mi RNA通过复杂交错的信号调节网络调控肿瘤生物学过程,探索mi RNA之间的协同作用、实现联合用药也是肝癌治疗的重要策略之一。研究目的:本研究通过合成新型p H响应性聚阳离子纳米材料,改善肝癌的mi RNA体内递送。利用该纳米载体,探究mi R-199a/b-3p mimics（mi R199）和antisense-mi R-10b（antimi R10b）在抗肝癌治疗中的协同作用（mi R-cocktail）,并实现基于个体mi RNA表达谱的mi RNA鸡尾酒替代治疗。研究方法:第一部分:本研究采用聚乙烯亚胺交联环糊精（PEI-βCD）作为基因载体核心主体,将弱酸p H响应性的CDM（Dlinkm）作为中间键连接PEG和金刚烷胺形成三嵌段客体结构,通过环糊精和金刚烷基团之间共价结合发生主客体自组装,合成新型mi RNA递送载体PEI-βCD@Ad-CDM-PEG（PCACP）,通过1H NMR表征化合物结构。PCACP包封mi R199后形成纳米粒,进行粒径、表面ζ电位、电镜观察、p H响应性、药物释放特性、细胞摄取和转染效率等性质表征。然后以人源Huh-7肝癌细胞株和Huh-7裸鼠肿瘤模型为对象,验证PCACP/mi R199系统的体外和体内抑瘤能力,治疗后细胞或肿瘤通过q RT-PCR对mi R-199a/b-3p表达水平进行定量、Western blot和免疫组化对mi R-199a/b-3p靶标蛋白表达量进行测定。第二部分:本文以PCACP为载体介导mi RNA递送。采用CCK-8法进行mi R199和antimi R10b体外肝癌细胞活力抑制实验并计算药物合用指数（CI）。在人源Huh-7肝癌细胞株和Huh-7裸鼠肿瘤模型上予以PCACP/mi R-cocktail治疗,证实mi R199和antimi R10b在肝癌增殖和转移中的协同增效作用,q RT-PCR对治疗后相关mi RNA表达进行定量,利用Western blot、免疫组化、Transwell实验等验证协同作用及其分子机制。建立PDX模型,根据原代肿瘤标本和癌旁组织进行mi RNA表达谱测序,针对个体mi RNA表达特征,在PDX荷瘤裸鼠上给予失调mi RNA协同调整治疗,通过肿瘤生长曲线、AFP水平检测判断治疗效果,Western blot和组织mi RNA测序揭示抑瘤机制。研究结果:第一部分:合成的PCACP载体可与mi R199在水中自组装形成纳米粒,在N/P=3时即可完全绑定mi RNA。纳米粒水合粒径为147.4±0.90 nm,表面ζ电位为19.83±1.36 m V,在p H 6.5弱酸刺激下CDM键断裂,脱去PEG外壳,粒径缩小至42.45±0.32 nm,而在中性溶液中保持结构稳定。在弱酸环境中mi RNA释放速率显着加快,半衰期为4.2 h、载药最大释放百分比达85.65%。激光共聚焦显微镜和流式细胞术显示,p H 6.5预处理后的纳米粒内吞作用和转染效率明显增强。活体荧光实时成像证实了PCACP/mi RNA体系的肿瘤靶向和聚集作用。体外和体内实验证明,肿瘤微环境酸刺激后的PCACP/mi R199系统可有效调控肝癌细胞内mi R-199a/b-3p表达水平,并通过调节m TOR/AKT及PAK4/Raf/MEK/ERK通路,抑制肿瘤增殖和分化能力,发挥抗肿瘤作用。第二部分:PCACP递送mi R199和antimi R10b抑制肝癌的IC50为2.66μg/m L,CI=0.26,存在协同增效作用。Huh-7细胞和移植瘤模型证明PCACP/mi R-cocktail可有效调节肿瘤内mi R-199a/b-3p和mi R-10b表达水平,并通过多条信号通路调节肿瘤增殖或侵袭相关蛋白如E-cadherin、vimentin、RHOC、p-m TOR和p-AKT等的表达,对PAK4/Raf/MEK/ERK通路的抑制作用也进一步加强,发挥协同抑制肿瘤生长的作用。Transwell和细胞划痕实验证实PCACP/mi R-cocktail可协同抑制肝癌细胞侵袭和转移能力。临床标本mi RNA表达谱测序,构建人源异种肿瘤移植模型（PDX）,并基于microarray调配个体化mi R-cocktail治疗方案,由PCACP体内输送,证实其抗肝癌作用。结论:本研究合成了一种具有p H敏感性、粒径可变性、高效转染能力的主客体自组装聚阳离子纳米材料PCACP,作为递送mi RNA的载体。在肿瘤微环境弱酸性刺激下,p H响应的CDM键断裂造成PEG外壳脱落降解、粒径缩小,促进肿瘤部位mi RNA积聚和转染。本研究通过体外和体内实验证实,PCACP携带mi R199和antimi R10b两药联用通过多条信号通路起到协同抗肿瘤的作用。在PDX模型中,进一步证实个体化PCACP/mi R-cocktail疗法的抑瘤效果。
李建旺[5]（2019）在《Six2介导E-cadherin导致肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的机制研究》文中研究指明背景与目的:肝细胞癌（HCC）是全球恶性肿瘤中最为常见之一,也是全球第二大癌症死亡原因,每年约有745,500人死亡。肝癌侵袭性强,复发率高,预后极差。肝癌易发生化疗耐药,常规化疗在晚期肝癌患者中疗效不佳。化疗耐药已然成为肝癌治疗失败的主因之一。因此,能否揭开肝癌化疗耐药的分子机制的谜团,从而有效解决化疗的耐药困境,已成为肝癌治疗成功与否的关键。Six2是Six同源框家族成员之一,参与间充质-上皮转化,参与肾脏的发育过程,起到促进肾间质细胞增殖,抑制细胞凋亡的作用。Six2缺乏导致间质祖细胞缺失、分化失调和严重肾发育不全。此外,Six2可以在哺乳动物肾脏发育过程中标记和调节多能自我更新的肾单位祖细胞。既往有研究表明,Six2促进乳腺癌的转移。KM plotter在线分析显示肝癌患者Six2表达水平与其总生存负相关。由于作用于胚胎发生的基因表达程序和细胞过程常在肿瘤中再现,尤其肿瘤干细胞可能导致细胞转移。而上皮-间充质转换（EMT）过程可能赋予了肿瘤细胞干性特征。肿瘤细胞干性和EMT与肿瘤化疗耐药及转移密切相关。因此,我们推测Six2基因的异常表达与肝癌细胞EMT的发生及干细胞表型的获得相关。E-cadherin是EMT的上皮标记物,作为肿瘤抑制基因参与肿瘤的转移和细胞干性的调节。然而,E-cadherin在肝癌中的调控机制仍不甚明了。并且,Six2在肝癌化疗敏感性中的作用也尚不清楚。为了明确Six2在肝癌的预后生存及化疗耐药中是否起作用及其可能的机制?本课题做了如下研究:材料与方法:1、采用免疫组织化学法、qRT-PCR和Western blot等技术检测Six2蛋白在肝细胞癌组织、配对癌旁正常组织以及肝癌细胞系中的表达情况,基于利用KM plotter在线工具对364例肝癌患者进行Six2表达程度与总生存率的相关性分析。2、应用干扰技术有效敲低Six2表达,利用5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导肝癌细胞凋亡,采用CCK8法和细胞凋亡检测Six2干扰与否对经5-FU处理后肝癌细胞活性和细胞凋亡的影响;并采用Western blot技术检测凋亡相关蛋白的表达。并进一步采用Spheroid成球实验、ALDH活性检测观察Six2干扰与否对肝癌细胞“干性”特征的影响,利用qRT-PCR技术检测Six2干扰与否对肝癌细胞中干细胞标志物基因的影响。3、建立过表达Six2和E-cadherin肝癌细胞,利用qRT-PCR和Western blot技术检测肝癌细胞中Six2不同表达对应E-cadherin的表达情况。利用5-FU诱导肝癌细胞凋亡,利用CCK8和Western blot技术分别检测细胞活性和凋亡相关蛋白的表达来验证E-cadherin表达与Six2介导的5-FU敏感性的关系。并进一步采用Spheroid成球实验、ALDH活性检测和干细胞标志物基因mRNA水平的检测验证E-cadherin表达与Six2介导肝癌细胞干性特征的关系。4、利用qRT-PCR和Western blot技术检测DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨5 uM处理Six2过表达与否的肝癌细胞中E-cadherin表达情况,采用甲基化特异性PCR检测Six2过表达与否的肝癌细胞中E-cadherin基因启动子CpG岛甲基化状态,以及L02,HepG2和Huh7细胞株中E-cadherin甲基化水平的差异,qRT-PCR验证肝癌组织中Six2和E-cadherin表达相关性。结果:1、HCC组织和细胞中Six2表达增高且与预后不良相关41例肝癌组织中Six2蛋白阳性表达率达39.0%,41例配对癌旁正常组织中Six2蛋白阳性表达率达12.2%（P<0.01）;肝癌组织中Six2的mRNA和蛋白水平均高于正常组织（P<0.01）,Six2的表达量与AFP值相关,而与年龄、性别、HBsAG、肿瘤大小,分化程度及临床分期无关。在肝癌细胞中Six2的表达均高于正常肝细胞（L02细胞株）,尤其在HepG2和Huh7细胞株中（P<0.01）。KM分析显示,高表达Six2的HCC患者为45.1%（164/364）,总体生存率明显低于低表达的HCC患者,有统计学差异（P<0.05）。2、Six2对肝癌细胞5-FU敏感性的负调控作用并增强肝癌细胞干性特征肝癌细胞株经有效敲低Six2表达后,与对照组比较,Six2-shRNA处理可增加5-FU诱导产生的凋亡率,使细胞活性下降（P<0.01）;并使得细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cleaved PARP的蛋白表达增高。有效敲低Six2与5-FU具有协同作用。Six2敲低可使肝癌细胞Spheroid成球能力、ALDH1活性均显着下降（P<0.01）;干细胞标志物蛋白Nanog和ALDH1表达下调。3、Six2通过调节E-cadherin表达控制肝癌细胞对5-FU敏感性和干性特征在Six2过表达或敲低的细胞中,E-cadherin的表达分别降低或增加（P<0.01）,在Six2过表达的细胞中转染E-cadherin过表达病毒,E-cadherin的表达恢复,我们观察到E-cadherin的重新表达挽救了 Six2过表达细胞对5-FU的敏感性（P<0.01）,足以恢复Six2过表达细胞中5-FU诱导的细胞凋亡。此外,恢复E-cadherin的表达减弱了 Six2过表达介导的肝癌干细胞的上调,其特征是干细胞标记物（ALDH 1和Nanog）表达减少,细胞球大小和数量减少,ALDH 1活性降低（均P<0.01）。4、Six2通过激活E-cadherin启动子甲基化抑制其表达使用5 μM甲基转移酶抑制剂Decitabine处理Six2过表达的肝癌细胞后,E-cadherin表达部分恢复（P<0.01）,而对照组细胞E-cadherin表达无进一步增加（P>0.05）。E-cadherin启动子甲基化分析表明,Six2过表达的肝癌细胞E-cadherin CpG岛甲基化显着增加（P<0.01）,表达高水平Six2和低水平E-cadherin的肝癌细胞呈现出高表达的E-cadherin启动子甲基化。而表达低水平的Six2和高水平的E-cadherin的正常肝细胞L02则相应地则呈现低表达的E-cadherin启动子甲基化（P<0.01）。相对应的,41例肝癌组织中Six2和E-cadherin的表达呈负相关（R2=0.4167,P<0.01）。结论:1、Six2可能参与HCC的进展;2、Six2可通过增强肝癌细胞的干细胞来降低肝癌细胞的化疗敏感性;3、Six2通过调节E-cadherin的表达,调节5-FU的敏感性和肝癌细胞干性;4、Six2可通过改变E-cadherin启动子的甲基化状态来抑制其表达。
张欢欢[6]（2019）在《海藻玉壶汤及其活性成分岩藻黄质对肝癌的影响》文中研究说明目的:考察海藻玉壶汤及岩藻黄质对人肝癌移植瘤裸鼠抗癌作用和对人肝癌细胞的作用;考察细胞关键蛋白表达水平,探索岩藻黄质的抗肝癌作用途径。方法:1.建立裸鼠移植瘤模型,分模型组（每日1次0.9%氯化钠溶液灌胃）、阳性对照组（盐酸多柔比星1 mg/kg,每日1次腹腔注射）、海藻玉壶汤高、中、低剂量组（660、330、165 mg/kg每日1次灌胃）,岩藻黄质（Fucoxanthin,FX）高、中、低剂量组（50、25、12.5 mg/kg每日1次灌胃）。治疗21天后,取肿瘤组织测瘤体积、常规HE染色;免疫组化检测肿瘤组织Cyclin D1、Bax;检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）。2.运用超高效液相色谱质谱联用技术,对海藻玉壶汤中FX进行鉴定。3.绘制细胞生长曲线;CCK-8法检测FX作用后对细胞活力的影响;克隆形成实验检测FX对细胞集落形成的影响;流式细胞术分析细胞周期;流式细胞Annexin V-FITC/PI双染法进行细胞凋亡检测。4.蛋白质组学分析:FX（10μM）分别作用人肝癌Hep3B细胞24、48 h,提取细胞总蛋白,运用i TRAQ技术结合高效液相色谱-串联质谱的定量蛋白质组学方法,分析和鉴定差异表达的蛋白质,并进行生物信息学分析;Western blot法验证关键差异蛋白表达。结果:1.海藻玉壶汤、FX对人肝癌Hep3B细胞小鼠移植瘤生长的影响海藻玉壶汤高、中、低剂量组与模型组比较,移植瘤体积较小,差异具有统计学意义（P<0.01）,海藻玉壶汤高、中、低剂量组抑瘤率分别为51.74%、46.93%、25.17%,低剂量组瘤体积高于模型组和高剂量组（P<0.05）。FX高、中、低剂量组与模型组比较,移植瘤体积较小,比较具有统计学意义（P<0.05）,岩藻黄质高、中剂量抑瘤率为51.34%、43.50%。海藻玉壶汤高剂量组与模型组比较,ALT明显降低（P<0.05）。HE染色观察肿瘤组织病理学改变:治疗组可见不同程度肿瘤细胞灶性坏死,胞核固缩深染。免疫组化可见海藻玉壶汤各组和岩藻黄质高、中剂量组的Cyclin D1蛋白阳性表达细胞数下降、Bax蛋白阳性表达增强。2.液质联用检测结果提示,岩藻黄质的提取离子色谱图,保留时间为10.94min。在海藻玉壶汤检测结果中,于相同的保留时间处,用相同的m/z值和质量偏差可提取出色谱峰;该色谱峰对应的二级谱图与岩藻黄质对照品的二级谱图有较好的匹配度。3.FX对人肝癌Hep3B、MHCC97h细胞活力、克隆形成、细胞周期及凋亡的影响。（1）FX抑制Hep3B、MHCC97h细胞增殖,并呈时间、浓度依赖。与Control组比较,FX 25μM作用24 h、FX 5μM作用48 h降低细胞活力,（P<0.05）,FX作用Hep3B细胞72 h的IC35、IC50值分别为10、14μM;与Control组比较,FX 25μM作用24 h降低细胞活力（P<0.05）,FX作用MHCC97h细胞72 h IC35、IC50值分别为16.9、20.5μM。（2）FX 10、14μM处理Hep3B细胞后,降低克隆形成率至40.00%、13.47%;FX 10、14μM处理MHCC97h细胞后,降低克隆形成率至52.60%、35.13%,与Control组比较,差异均具有统计学意义（P<0.01）。（3）FX作用于Hep3B、MHCC97h细胞阻滞细胞周期于G1期。FX作用Hep3B细胞24 h后,与Control组比较,FX 14μM组G0/G1期细胞含量上升（P<0.01）。作用48 h后,与Control组比较,FX 10μM组、FX 14μM组G0/G1期细胞含量上升（P<0.01）。FX作用MHCC97h细胞24 h后,与Control组比较,FX 10μM组、FX 14μM组G0/G1期细胞含量上升（P<0.01）。作用48 h后,与Control组比较,FX 10μM组、FX 14μM组G0/G1期细胞含量上升（P<0.01）。（4）FX作用Hep3B细胞24 h后,与Control组比较,FX10、14μM凋亡率上升（P<0.01）;作用48 h后与Control组比较,FX 10μM组、FX 14μM凋亡率上升（P<0.01）,与FX 10μM组比较,FX 14μM组凋亡率上升（P<0.01）。FX作用MHCC97h细胞24 h后,FX 14μM组与Control组比较,凋亡率上升（P<0.01）,与FX 10μM组比较,FX 14μM组凋亡率上升（P<0.01）;作用48 h后,与Control组比较,FX 10μM组、FX 14μM组凋亡率上升（P<0.01）。4.蛋白质组学分析（1）实验共鉴定肽段匹配到的图谱77064个,唯一肽段为27883个,高置信度的蛋白质总数为5092个。设定差异倍数2倍以上为显着差异,FX处理24 h上调差异蛋白97个,下调87个;处理48 h上调差异蛋白30个,下调43个。（2）对FX作用后差异蛋白进行基因本体分析。生物进程分析发现差异蛋白主要集中在代谢进程、生物调节等方面。细胞组分分析发现,差异蛋白主要分布在细胞器、膜。另外,FX作用24 h后,差异蛋白细胞组分还分布在细胞连接上。分子功能分析提示,差异蛋白分子主要具有催化活性、结合等功能。信号通路分析发现,差异蛋白富集信号通路主要有Pathways in cancer等。蛋白互作分析差异蛋白发现,RPS6KA1、NOP2、MIF、CDK12、SQSTM1、STAT3、MDH2、ATP5I等蛋白发挥关键作用,经Western blot验证,FX作用后RPS6KA1、NOP2、MIF、CDK12、STAT3、MDH2、ATP5I蛋白水平下调,SQSTM1蛋白水平上调。结论:1.海藻玉壶汤及其活性成分岩藻黄质可剂量依赖性显着抑制裸鼠Hep3B移植瘤生长。2.岩藻黄质在体外明显抑制人肝癌Hep3B、MHCC97h细胞活力,细胞克隆形成数目下降,可能是通过诱导细胞发生G1期细胞周期阻滞、促细胞凋亡发挥抗癌作用。3.岩藻黄质可调控多种蛋白:细胞器、膜、胞外区等,这些蛋白大多具有结合、催化活性、转运活性等功能,参与代谢进程、生物调节、组织细胞组成或生物合成等生物过程;相关通路主要有Pathways in cancer等。岩藻黄质调控的关键蛋白群具有调控细胞周期进程、抑制巨噬细胞移动、介导信号转导和转录活化、促进自噬等作用;FX可能通过调节该关键蛋白群,发挥诱导细胞周期阻滞、凋亡作用,从而抑制Hep3B细胞增殖、活力、集落形成。
宋伟[7]（2019）在《HBx上调的LncRNA TRERNA1在促进肝细胞癌进展及预后不良中作用机制研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种具有高复发率和高死亡率的恶性肿瘤疾病。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）编码的X蛋白（HBx）以多种方式,包括基因畸变和失调、表观遗传学修饰改变及非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）调控等在HCC细胞增殖和转移等过程中发挥重要生物学作用。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度超过200 bp不编码蛋白质的RNA分子,通过挥信号、诱饵、指导或支架的作用方式参与肿瘤的多种生物学过程。HCC中lncRNA的研究结果提示lncRNA可影响HCC的增殖、转移、凋亡等多种功能,HBx亦可通过调控相关分子表达,特别是表观遗传调控方式参与肝癌的发生发展。进一步探究HBx诱导lncRNA及其在HCC恶性进展中的作用机制,将有助于肝癌的有效诊断和靶向治疗策略的制定。本研究应用lncRNA芯片和m RNA芯片分析HBx影响HCC细胞差异表达的lncRNA表达谱和m RNA表达谱;lncRNA TRERNA1因其在过表达HBx细胞中差异表达显着而作为进一步研究的候选分子;通过HBx质粒转染以及RNA干扰（RNAi）方法检测HBx对lncRNA TRERNA1的表达水平的关系;实时定量PCR（Quantitative Real-time PCR,q-PCR）方法检测TRERNA1与HBx在HCC病例组织和HCC细胞中表达水平相关性;细胞划痕实验,Transwell迁移和Matrigel侵袭实验检测TRERNA1对HCC细胞迁移和侵袭能力的影响;裸鼠尾静脉注射建立肿瘤转移模型,以苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,H&E）染色方法检测TRERNA1在体内转移结节的形成;Q-PCR、Western blot分别检测TRERNA1对可能靶基因CDH1 m RNA和蛋白表达水平的影响;RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）、免疫共沉淀（Immunoprecipitation,IP）实验检测TRERNA1与EHMT2、SNAI1三者之间的相互结合。染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）方法分析EHMT2与CDH1启动子区的结合;Q-PCR法检测CDH1在HCC病例中的表达水平及其与TRERNA1转录水平之间的关系;RNA原位杂交方法评估TRERNA1在HCC病例中的表达情况及其对HCC预后不良的关系;通过GO和KEGG Pathway分析TRERNA1可能参与的生物学功能和信号通路;CCK-8增殖实验、平板克隆形成、流式细胞术以及裸鼠皮下成瘤实验检测TRERNA1对HCC细胞增殖能力的影响;Western blot用于检测细胞周期相关蛋白的表达;CCK-8法用于检测TRERNA1对索拉菲尼治疗HCC敏感性的影响,同时Western blot检测TRERNA1对Raf-MEK-ERK磷酸化通路的影响。通过以上研究获得如下研究结果:1 HBx上调了lncRNA TRERNA1的表达,且TRERNA1表达水平与HBx表达存在剂量依赖关系;2 HCC组织中的研究发现TRERNA1的表达水平与HCC转移和分期密切相关,且与HCC患者预后不良有关;3体内外实验研究结果表明,表达上调的TRERNA1不仅促进HCC细胞的迁移和侵袭能力,TRERNA1高表达促进了HCC细胞的增殖和裸鼠移植瘤的生长;4高表达的TRERNA1降低了索拉非尼对HCC细胞的敏感性,与HCC预后不良有关;5结合GO和KEGG Pathway分析过表达TRERNA1表达诱导的差异基因表达谱,发现TRERNA1参与调控的基因主要集中在调控细胞增殖、细胞周期等相关功能;6 TRERNA1以分子支架功能,通过招募EHMT2/SNAI1复合体使CDH1启动子区发生H3K9二甲基化从而抑制CDH1表达,同时TRERNA1发挥增强子样功能激活其邻近基因SNAI1的表达,促进HCC细胞的侵袭转移能力;7 TRERNA1抑制p21蛋白的表达,上调细胞周期调控分子Cyclin D1、CDK2和CDK4的表达,促进HCC细胞G1/S期的转换,增强HCC细胞的增殖能力;8 TRERNA1通过激活磷酸化Raf-MEK-ERK信号通路降低了HCC靶向药物索拉菲尼对HCC治疗的敏感性。综上所述,我们通过研究首次揭示,受HBx诱导的lncRNA TRERNA1通过招募EHMT2/SNAI1复合体抑制了CDH1的表达从而促进HCC的转移。TRERNA1通过激活磷酸化Raf-MEK-ERK通路,降低了索拉菲尼对HCC细胞的敏感性。深入研究lncRNA TRERNA1作用将有助于揭示促进HCC进展的分子机制,并有利于评估HCC靶向药物治疗疗效,将为HCC患者的诊断和治疗提供新的研究策略。
胡光辉[8]（2019）在《第一部分 LKB1在结直肠癌中的功能研究第二部分 剪接异构体CHK1-S在肝癌中的作用及其临床意义》文中指出LKB1,也称为丝氨酸/苏氨酸激酶11（STK11）,最早在Peutz-Jeghers综合征（PJS）中被鉴定失活突变。LKB1常与假激酶STRAD和支架蛋白M025形成复合物,以调节自身蛋白稳定性、激酶活性和亚细胞定位。LKB1可直接磷酸化AMPK和其他12种AMPK样激酶,参与调控细胞的生长、代谢、自噬和极性。大量研究表明LKB1为抑癌基因,其失活突变与多种肿瘤中发生发展相关,如肺癌、皮肤癌等。虽然人们研究表明LKB1在结直肠癌中的突变较低,但其低表达与结直肠癌患者不良预后相关。为研究LKB1在结直肠癌中的作用,首先我们利用Cas9技术构建稳定敲除LKB1的结直肠癌细胞株。利用CCK-8实验研究LKB1对结直肠癌细胞增殖的影响,结果发现LKB1的敲除对结直肠癌细胞增殖的影响不显着。我们用AOM/DSS诱导LKB1肠道条件敲除小鼠的结直肠形成肿瘤,发现LKB1条件性敲除小鼠肠道肿瘤数目和对照小鼠的结直肠肿瘤数目无明显差异。通过细胞的迁移和侵袭实验,我们发现LKB1的敲除促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭。通过小鼠尾静脉肺转移实验,发现LKB1的敲除促进结直肠癌细胞的肺转移。为了探讨LKB1的敲除如何促进结直肠癌细胞迁移和侵袭,我们使用RNA-seq测序,分别分析HCT116和HCT15两株细胞在LKB1敲除前后基因的差异表达情况。结果发现在两组细胞中有44个共同的差异表达基因,其中包括与结直肠癌相关的基因TNIK。为了探讨LKB1与TNIK间的调控关系,我们首先通过在结直肠癌细胞中敲除和过表达LKB1,发现LKB1能够负调控TNIK的表达;且LKB1激酶失活突变不能有效抑制TNIK的表达,表明LKB1负调控TNIK的表达依赖其激酶活性。为了明确TNIK对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响,我们首先构建稳定敲降TNIK的细胞。迁移和侵袭实验表明,敲降TNIK可以抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。为了探究LKB1是否通过调控TNIK的表达影响结直肠癌细胞迁移和侵袭能力,我们在LKB1敲除的HCT116结直肠癌细胞中敲降TNIK的表达,体内外实验结果表明LKB1的敲除促进结直肠癌细胞的迁移、侵袭以及小鼠体内的肺转移部分依赖于TNIK的表达。为了进一步探讨TNIK影响结直肠癌细胞迁移和侵袭的机制,我们利用质谱分析了与TNIK作用的蛋白,结果发现TNIK可与细胞骨架相关蛋白ARHGAP29相互作用。有文章表明ARHAGP29可以抑制RhoA的活性,进而抑制促肌动蛋白解聚因子cofilin的磷酸化,使其发挥对肌动蛋白的解聚活性,最终加速细胞肌动蛋白骨架的重塑过程。我们在结直肠癌细胞中过表达TNIK或者缺失LKB1,结果发现cofilin的磷酸化水平都下降。此外,我们还使用免疫荧光检测肌动蛋白形成的伪足,结果发现在结直肠癌细胞中过表达TNIK或者缺失LKB1其细胞周围的伪足都明显增多。以上结果提示TNIK对细胞微丝骨架重塑可能在LKB1影响结直肠癌细胞的迁移和侵袭过程中起一定作用。此外,我们还初步探讨了 LKB1对肿瘤微环境中巨噬细胞的影响,肿瘤微环境中的巨噬细胞通常被分为两种极化形式,即抗肿瘤的M1型和促肿瘤的M2型。我们使用LKB1敲除的结直肠癌细胞条件培养基刺激巨噬细胞,通过Q-PCR和免疫荧光染色方法检测M1和M2的相关分子的表达,结果发现LKB1敲除的结直肠癌细胞条件培养基可诱导巨噬细胞的极性偏向于M2型的状态。综上,我们的研究结果表明,LKB1的敲除对结直肠癌细胞增殖的影响不显着,但其对结直肠癌细胞的转移能力显着增强。LKB1的敲除增强结直肠癌细胞的转移能力部分依赖于TNIK的表达和TNIK影响的细胞骨架重塑。本研究通过揭示LKB1的敲除增强结直肠癌细胞转移能力的可能机制,为结直肠癌的治疗提供新思路。此外,通过初步研究LKB1敲除的结直肠癌细胞条件培养基对巨噬细胞极性的影响,丰富了 LKB1在结直肠癌中的作用。基因的选择性剪接是pre-mRNA加工过程中选择性的包含或删除不同外显子和内含子,该过程可产生不同成熟的mRNA,极大丰富了基因转录组和蛋白组的多样性,据估计人类中高达94%的基因可发生选择性剪接。基因的选择性剪接参与组织特异性的形成和正常发育调控等正常生命活动。基因选择性剪接异常与人类多种疾病相关,包括肿瘤。基因的选择性剪接异常与肿瘤的发生发展密切相关,其剪接异构体也可作为肿瘤分子标记物和治疗的靶点。基因的选择性剪接异常参与肿瘤的发生发展是多方面的,包括细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤细胞的代谢、血管生成及肿瘤转移。目前基因剪接异常在多种肿瘤中被相继报道和研究,然而其在肝细胞癌中的研究还不是很多。为了研究肝癌中基因的剪接异常,我们使用HTA2.0基因芯片,分析术后2年内复发和未复发肝癌患者的肝癌组织样本各5例中基因选择性剪接差异,发现细胞周期相关的CHK1基因的差异剪接。CHK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,调节DNA损伤反应。在本研究中,我们检测了肝细胞癌（HCC）组织中选择性剪接体CHK1-S（3号外显子缺失）的mRNA水平。我们的结果显示,与配对的癌旁组织相比,CHK1-S在HCC组织中显着高表达。CHK1-S的高剪接率与术后HCC患者的无复发生存期（RFS）密切相关。为了进一步探究CHK1-S在HCC中的作用,我们使用CCK-8实验、EdU掺入实验和集落形成实验。结果显示,与正常CHK1（CHK1-L）相比,CHK1-S的过表达显着促进肝癌细胞的增殖。为了探讨CHK1-S的剪接机制,我们分析前面基因芯片数据中与剪接相关的基因,发现了可调控剪接因子活性的剪接因子激酶SRPK1存在表达差异,在肝癌组织中进一步验证其mRNA水平和蛋白水平,发现SRPK1在肝癌组织中的表达水平都显着高于其配对的癌旁组织,并且SRPK1的mRNA 水平与CHK1-S的水平正相关（P=0.016）。当我们HepG2和QSG-7701细胞中过表达SRPK1,发现可使CHK1-S的蛋白水平升高,这表明SRPK1参与调控CHK1-S剪接异构体的形成。总之,我们的研究表明,CHK1-S在肝癌中发挥癌基因的作用,其表达水平表达与RFS相关;SRPK1可介导CHK1-S在肝癌中的剪接。我们的研究结果提示表明CHK1-S的表达在HCC预后评估中具有潜在的应用价值,且剪接因子激酶SRPK1可作为潜在的治疗靶点。
姜浩[9]（2017）在《抑癌因子ARID2和TPI1在肝癌发生和发展过程中的功能及其机制研究》文中研究指明1.肝癌是严重威胁人类健康的一种恶性肿瘤,具有较高的发病率和致死率。从世界范围来看,东亚地区的韩国、日本是肝癌发生的重灾区,而我国的情况比这些重灾区更严重。虽然肝癌发生的诱因已基本清楚,但是术后复发和转移仍是肝癌致死的主要原因。所以,控制复发和转移是肝癌研究和治疗的重点、难点。ARID2是SWI/SNF复合物的一个亚基,具有调控基因转录、细胞周期、胚胎发育、细胞生长的功能,在多种生理过程中起着重要作用。ARID2是一个潜在的抑癌因子,其突变普遍存在于人类肿瘤中,而在肝癌中的突变尤为突出。报道显示ARID2能抑制肝癌细胞的周期和生长,但ARID2在肝癌转移中的功能和机制还不清楚。本研究旨在探索ARID2在肝癌转移中的功能和潜在机制,以期为肝癌的临床治疗提供科研依据。本研究发现,ARID2的转录和翻译在肝癌组织中降低,尤其在转移性肝癌组织（PVTT）中降低最明显;并且ARID2的表达与肝癌的组织分级、肿瘤大小以及器官转移负相关,与肝癌患者的肿瘤复发时间和预后正相关。在肝癌细胞中过表达ARID2会抑制细胞的体外迁移和侵袭,干扰ARID2表达则促进肝癌细胞的体外迁移、侵袭。同时,过表达ARID2减少肝癌细胞的肝内转移和器官转移,在肝癌细胞中干扰ARID2表达则增加细胞的肝内转移和器官转移。而且,在小鼠原发肝癌模型中敲除ARID2会促进原发肝癌的发生和肝癌细胞的内脏器官转移,表型与以上结果一致。此外,ARID2抑制肝癌细胞的EMT过程,调控EMT相关micro RNA的转录,以及改变组蛋白H3的表观遗传修饰。上述结果暗示,ARID2可能通过调控组蛋白的表观修饰,对EMT相关的microRNA进行转录调控,从而抑制肝癌细胞的EMT,发挥抑制肝癌转移的作用。我们的研究结果证明,ARID2是一个肿瘤抑制因子,能抑制肝癌的转移,为肝癌的临床治疗提供了新思路和理论依据。2.代谢紊乱是肿瘤主要特征之一,几乎在所有的肿瘤中都能观察到。丙糖磷酸异构酶（Triosephosphate isomerase1,TPI1）是糖酵解和糖异生过程中的催化酶,能催化二羟丙酮磷酸（DHAP）与D型-3-磷酸-甘油醛（G3P）之间相互转化,在碳水化合物代谢中起着关键性作用。虽然以前的研究暗示TPI1在肿瘤发生过程中有重要作用,但是TPI1在肿瘤中的生物学功能和潜在调控机制仍然不清楚,所以本论文的第二个方面主要对TPI1在肝癌中的功能和机制进行探索。我们的研究发现TPI1的表达在肝癌组织中降低,并且与肝癌病人的存活时间正相关,与肿瘤的组织分化、肿瘤体积和器官转移负相关。在肝癌细胞中过表达TPI1能抑制细胞的体外生长、体外迁移和侵袭。相反,利用shRNA在肝癌细胞中干扰TPI1的表达,能促进肝癌细胞的体外生长、体外迁移和侵袭。而且,过表达TPI1能抑制肝癌细胞的体内生长,控制肿瘤的形成。此外,过表达TPI1会诱导细胞周期停滞。分析其潜在机制发现,上述表型与转移相关因子β-catenin和Vimentin,以及周期相关因子P53、P27和CyclinD1的表达变化有关。所以,我们的结果暗示:TPI1是一个肝癌抑制因子,也是治疗肝癌的潜在靶点。
赵霏[10]（2016）在《灰树花多糖联合维生素C诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡与自噬的研究》文中进行了进一步梳理背景:肝细胞性肝癌是发病率和死亡率高且预后极差的恶性肿瘤之一。目前临床的治疗方法包括外科手术切除、TACE术、放化疗、免疫治疗、基因治疗等,但大多难以控制疾病的进展。化学药物治疗是目前使用最多的方法,但所应用的化疗药物对病人的毒副作用较大且疗效不高。因此研发既有抗癌活性同时毒副作用低的新型抗肿瘤药物一直是研究的重点。近些年从天然产物中提取有效抗肿瘤活性成分已成为一种新的研究趋势。灰树花多糖（Grifola frondosa polysaccharide,GFP）是从药食同源菌种灰树花子实体及菌丝体中提取出的一种具有广泛药理作用的活性物质。已有研究报道过GFP对肿瘤细胞的增殖具有较显着的抑制作用,且抗肿瘤效应的分子机制为诱导细胞凋亡。同时维生素C（Vitamin C,VC）也曾被报道过在体外实验中具有诱导骨肉瘤细胞凋亡和诱导骨髓基质细胞自噬的作用。目的:本研究拟通过对灰树花多糖抗肿瘤的文献进行计量学分析,同时对多糖抑瘤效应中凋亡的作用进行Meta分析的研究方法,来了解灰树花多糖抗肿瘤方面研究的现状并探讨多糖抗肿瘤主要的分子机制,并在此基础上进行下一步的实验研究。探讨联合应用灰树花多糖和维生素C对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响,验证二者在抗肿瘤效应上是否具有协同增效作用,此外阐明凋亡与自噬在联合用药治疗肝癌细胞过程中发挥的作用,并进一步探讨联合用药诱导肝癌细胞凋亡和自噬发生的具体分子机制,为有效指导临床实践用药,开拓临床治疗肝癌新思路提供实验基础。方法:本研究首先对灰树花提取物生物活性的相关研究文献进行计量学分析,并应用可视化技术对灰树花多糖抗肿瘤研究的现状进行全面的了解。其次通过系统评价与Meta分析的方法对灰树花多糖抑瘤作用的分子机制进行分析,探讨灰树花多糖抗肿瘤效应中诱导细胞凋亡的作用。随后进行实验研究,对于从灰树花子实体中提取出来的多糖以及常规药物维生素C,采用MTT法分别检测单用药和联合用药后对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响;应用等效线图解法研究联合用药时二者之间的相互关系并寻求最佳联合用药浓度;流式细胞术检测联合用药对细胞周期的影响;annexinv-fitc/pi双染色法检测对细胞凋亡的诱导作用;用倒置生物显微镜观察药物干预后smmc-7721细胞形态学的改变,并进一步用透射电镜观察细胞的超微结构变化;同时用hoechst33258凋亡荧光染色剂和mdc自噬荧光染色剂对细胞进行处理后,通过荧光显微镜观察细胞凋亡和自噬的发生情况;应用westernblotting（wb）法检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2、parp及自噬相关蛋白beclin-1、lc3、akt和phospho-akt蛋白的表达情况;通过比较全细胞蛋白和胞质蛋白中细胞色素c的表达量来判断此过程中是否有细胞色素c的释放;另外分别检测药物处理后细胞中caspase-3、caspase-8和caspase-9活性变化情况。从分子生物学水平检测细胞凋亡与自噬水平的改变,并探讨此过程中细胞遵循何种信号转导通路发生凋亡和自噬。结果:文献分析结果显示,在对灰树花提取物生物活性的诸多研究中,灰树花多糖的抗肿瘤效应一直是研究的重点与热点,而系统评价和meta分析结果表明诱导肿瘤细胞发生凋亡是其发挥抑瘤效应的主要机制。实验结果显示,灰树花多糖和维生素c均可抑制肝癌smmc-7721细胞增殖,且呈时间-剂量依赖性。等效线图解法分析结果表明小剂量的gfp（<0.6mg/ml）与vc联合应用时,二者具有协同增效抗肿瘤作用,根据mtt结果最终选定联合用药浓度为0.2mg/mlgfp联合0.3mmvc,此时联合用药对smmc-7721细胞抑制率为68.81%±1.12,高于单用gfp（16.03%±1.80）和vc（29.85%±1.02）。流式细胞术检测结果显示联合用药后细胞发生g2/m期阻滞,且细胞凋亡率从对照组的3.22%±0.23上升至联合用药组的64.45%±1.41,而联合用药组的细胞凋亡率分别是gfp组的6.88倍和vc组的2.24倍。药物处理肝癌细胞24小时后,光学显微镜与透射电镜下均可观察到细胞形态发生改变,出现染色质边集、胞质疏松等早期凋亡现象,同时在胞质中可观察到有双层膜结构的自噬泡出现。hoechst33258染色后,gfp、vc及联合用药处理的细胞中均可观察到典型的细胞核偏向一侧的凋亡细胞核变化情况。mdc染色后vc与联合用药干预后可在细胞胞质中见到荧光加强的自噬颗粒,且凋亡与自噬现象均是联合用药组更加明显。wb结果显示联合药物干预后,与对照组相比,促凋亡蛋白bax表达上调、抗凋亡蛋白bcl-2表达下降、caspase-3底物parp表达增强。同时对照组、gfp、vc与联合用药组四个组全细胞蛋白中的细胞色素c表达无差别,而除对照组外其余三个组细胞的胞质蛋白中细胞色素c表达增强,说明药物干预后细胞色素c释放到胞质中。此外,联合用药后细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性均增强。提示联合用药后肝癌细胞smmc-7721凋亡水平上升,且主要遵循内源性线粒体途径发生凋亡。wb结果同时显示,联合用药后细胞自噬相关蛋白beclin-1表达增强、自噬分子标志物LC3-II表达上调,LC3-II/LC3-I比例上升,说明细胞自噬活性增强,但在接下来的WB实验中,细胞总Akt和phospho-Akt蛋白表达均增强,说明经典负性调控的自噬信号转导途径PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号转导通路可能不参与此过程。结论:文献计量学分析结果表明,灰树花多糖的抗肿瘤作用一直是其生物活性研究的重点。Meta分析结果也显示,多糖抑瘤效应主要的分子机制为诱导肿瘤细胞凋亡。进一步的实验结果提示,小剂量的GFP联合VC对肝癌细胞SMMC-7721具有显着的抗肿瘤活性,且二者具有协同增效作用。药物干预后细胞的凋亡和自噬均被激活,药物一方面通过内源性线粒体途径诱导细胞凋亡,另一方面诱导细胞发生自噬,从而发挥抑制肿瘤的效应。
二、反义甲基转移酶基因片段增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导对肝癌细胞的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、反义甲基转移酶基因片段增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导对肝癌细胞的作用（论文提纲范文）
（1）LINC13及ACTR分别调控氧化应激及糖酵解介导肝癌耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 肝癌OXA耐药相关新分子LINC13 及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LINC13 调控SM1 介导肝癌OXA耐药的可能机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 肝癌细胞中LINC13 调控SM1 的分子机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 LINC13-SF1-SM1轴促进抗氧化应激反应导致OXA耐药 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 ACTR调控糖酵解作用介导肝癌索拉非尼耐药 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在肝细胞癌耐药中的作用机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）肝癌和癌栓的全基因组甲基化分析及差异基因的相关临床特征研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩写词对照表 |
| 绪论 |
| 第一部分 肝细胞肝癌组织及门静脉癌栓(PVTT)组织的DNA甲基化组学分析 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 患者一般临床病例学资料 |
| 3.2 肝细胞肝癌原发灶和门静脉癌栓的全甲基化组特征 |
| 3.3 差异甲基化基因特征分析 |
| 3.4 癌旁组织到肝癌原发灶组织再到门静脉癌栓组织甲基化发生梯度改变的基因 |
| 3.5 关键梯度变化基因分析 |
| 3.6 甲基化转移酶抑制剂地西他滨(DAC)和重组人肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(rh-TRAIL)在体外实验中能够协同作用于肝癌细胞系抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第二部分 候选基因(DNAH17 以及ADRA1A)在肝癌中的甲基化特征分析及、肝癌临床病理学特征相关性分析及机制研究 |
| 1 引言 |
| 1.1 DNAH17基因 |
| 1.2 ADRA1A基因 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 DNAH17基因甲基化与肝癌临床特征相关性分析 |
| 3.2 ADRA1A基因甲基化与肝癌临床特征相关性分析及潜在机制探索 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DNAH17甲基化水平研究讨论 |
| 4.2 ADRA1A甲基化水平研究讨论 |
| 5 本章小结 |
| 5.1 在HCC中检测到DNAH17基因的低甲基化状态 |
| 5.2 笔者观察到 ADRA1A 在 HCC 中的低表达和高甲基化 |
| 参考文献 |
| 综述 肝细胞肝癌中 E-cadherin 蛋白基因组及表观修饰调控机制 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间科研成果 |
（3）LncRNA HOTAIR调控通路遗传变异与肝癌易感性关联研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 课题思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 资料收集 |
| 2.2.1 流行病学调查 |
| 2.2.2 血液样本采集 |
| 2.3 遗传变异的选择 |
| 2.4 实验试剂和设备 |
| 2.4.1 主要实验试剂 |
| 2.4.2 主要实验设备 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 乙肝两对半定性检测 |
| 2.5.2 人血液基因组DNA提取 |
| 2.5.3 基因型检测 |
| 2.6 统计学分析 |
| 2.6.1 研究对象基本特征分析 |
| 2.6.2 最佳遗传模型的筛选 |
| 2.6.3 遗传变异基因型分布及其与肝癌发生发展的关联性分析 |
| 2.6.4 单体型与肝癌发病风险的关联性分析 |
| 2.6.5 遗传风险评分与肝癌发病风险的关联性分析 |
| 2.6.6 遗传变异-环境、遗传变异-遗传变异交互和中介效应分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 遗传变异与肝癌发生的关联性分析 |
| 3.1.1 研究对象基本特征 |
| 3.1.2 遗传模型筛选 |
| 3.1.3 单个遗传变异与肝癌发病风险的关联性分析 |
| 3.1.4 单体型与肝癌发病风险的关联性分析 |
| 3.1.5 遗传变异风险评分与肝癌发病风险的关联性分析 |
| 3.2 遗传变异-环境、遗传变异-遗传变异交互作用对肝癌发生的影响 |
| 3.2.1 HOTAIR基因遗传变异与环境因素两两交互作用 |
| 3.2.2 EZH2基因遗传变异与环境因素两两交互作用 |
| 3.2.3 TP53基因遗传变异与环境因素两两交互作用 |
| 3.2.4 PTEN基因遗传变异与环境因素两两交互作用 |
| 3.2.5 基因间遗传变异-遗传变异两两交互作用 |
| 3.2.6 应用MDR分析遗传变异-环境和遗传变异-遗传变异高阶交互作用 |
| 3.2.7 应用CART分析遗传变异-环境和遗传变异-遗传变异高阶交互作用 |
| 3.3 应用四向分解法分析遗传变异-环境和遗传变异-遗传变异中介效应 |
| 3.4 探索影响肝癌临床特征的危险因素 |
| 3.4.1 肝癌患者的TNM分期和门静脉癌栓情况 |
| 3.4.2 基因遗传变异与肝癌临床特征的关联性分析 |
| 3.4.3 遗传变异-环境交互作用对肝癌临床特征的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 环境因素对肝癌发生的影响 |
| 4.2 HOTAIR调控通路遗传变异对肝癌易感性影响 |
| 4.2.1 HOTAIR基因遗传变异对肝癌易感性影响 |
| 4.2.2 EZH2基因遗传变异对肝癌易感性影响 |
| 4.2.3 PTEN基因遗传变异对肝癌易感性影响 |
| 4.3 交互作用对肝癌易感性影响 |
| 4.3.1 遗传变异-环境交互作用对肝癌易感性影响 |
| 4.3.2 遗传变异-遗传变异交互作用对肝癌易感性影响 |
| 4.4 HOTAIR调控通路遗传变异对肝癌临床特征的影响 |
| 第五章 创新与不足 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（4）肿瘤响应纳米药物构建及个体化miRNA鸡尾酒疗法治疗肝癌（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 绪论 |
| 1 第一部分一种p H响应性修饰的多聚物纳米材料用于肝癌的mi RNA治疗 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 实验材料与仪器 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 PEI-βCD@Ad-CDM-PEG(PCACP)的合成 |
| 1.3.2 PCACP材料表征 |
| 1.3.3 PCACP/mi RNA系统的形态及物理化学表征 |
| 1.3.4 细胞与动物 |
| 1.3.5 PCACP/mi RNA的肝癌靶向能力研究 |
| 1.3.6 PCACP/mi R199 疗效的细胞学研究 |
| 1.3.7 PCACP/mi R199 疗效的体内动物学研究 |
| 1.3.8 统计分析方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 PEI-βCD@Ad-CDM-PEG(PCACP)合成及表征 |
| 1.4.2 PCACP的 mi RNA包封能力和形态学研究 |
| 1.4.3 PCACP/mi RNA系统的肝癌靶向能力研究 |
| 1.4.4 PCACP携带mi R199 肝癌疗效的细胞学研究 |
| 1.4.5 PCACP/mi R199 疗效的体内动物学研究 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 本章小结 |
| 2 第二部分依赖于p H响应纳米载体的个体化mi RNA鸡尾酒疗法介导肝癌治疗 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 PEI-βCD@Ad-CDM-PEG(PCACP)的合成 |
| 2.3.2 PCACP材料表征 |
| 2.3.3 PCACP/mi R-cocktail系统的制备 |
| 2.3.4 细胞与动物 |
| 2.3.5 PCACP/mi R-cocktail疗效的细胞学研究 |
| 2.3.6 PCACP/mi R-cocktail疗效的体内动物学研究 |
| 2.3.7 PCACP携带mi RNA个体化疗效研究 |
| 2.3.8 统计分析方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肝癌中mi R-199a/b-3p及 mi R-10b表达存在关联性 |
| 2.4.2 PCACP/mi R-cocktail疗效的细胞学研究 |
| 2.4.3 PCACP/mi R-cocktail疗效的体内动物学研究 |
| 2.4.4 PCACP携带mi RNA个体化疗效研究 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 综述 microRNA 在肝癌诊治中的应用进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（5）Six2介导E-cadherin导致肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 SIX2在肝癌中的表达及与预后的关系 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结和讨论 |
| 第二章 SIX2蛋白在肝癌细胞中的作用 |
| 第一节 有效敲低SIX2可增加肝癌细胞对5-FU的敏感性 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结和讨论 |
| 第二节 有效敲低SIX2可减弱肝癌细胞干性特征 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结和讨论 |
| 第三章 SIX2调控E-CADHERIN在肝癌中的表达及其作用 |
| 第一节 SIX2调节E-CADHERIN表达控制肝癌细胞对5-FU敏感性 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结和讨论 |
| 第二节 SIX2下调E-CADHERIN表达增强肝癌细胞干性特征 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结和讨论 |
| 第四章 SIX2通过刺激启动子甲基化抑制E-CADHERIN表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 小结和讨论 |
| 全文小结与结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 缩写词简表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（6）海藻玉壶汤及其活性成分岩藻黄质对肝癌的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 海藻玉壶汤抗肝癌作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞株 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 动物模型制备 |
| 2.3 药物制备 |
| 2.4 分组与处理 |
| 2.5 病理检测 |
| 2.6 ALT、AST检测 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 海藻玉壶汤对Hep3B移植瘤小鼠瘤体积的影响 |
| 3.2 海藻玉壶汤对人肝癌Hep3B细胞移植瘤裸鼠肝功能影响 |
| 3.3 HE染色 |
| 3.4 免疫组化 |
| 4 小结 |
| 第二部分 海藻玉壶汤活性成分岩藻黄质抗肝癌作用 |
| 第一节 基于液质联用技术对海藻玉壶汤中岩藻黄质的鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验药品 |
| 1.2 主要材料与试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 样品制备 |
| 2.2 分离与检测 |
| 3 结果 |
| 第二节 岩藻黄质体内抗肝癌活性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验细胞 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 动物模型制备 |
| 2.3 药物制备 |
| 2.4 分组与处理 |
| 2.5 病理检测 |
| 2.6 ALT、AST检测 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 岩藻黄质对人肝癌Hep3B细胞移植瘤生长的影响 |
| 3.2 岩藻黄质对人肝癌Hep3B细胞移植瘤裸鼠肝功能影响 |
| 3.3 HE染色 |
| 3.4 免疫组化 |
| 第三节 岩藻黄质体外抗肝癌作用研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 药物组成及制备 |
| 2.2 绘制生长曲线 |
| 2.3 Cell Counting Kit-8(CCK-8 法)检测岩藻黄质对细胞活力的影响 |
| 2.4 克隆形成实验 |
| 2.5 细胞周期实验 |
| 2.6 细胞凋亡实验 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 绘制生长曲线 |
| 3.2 CCk-8 法检测岩藻黄质对Hep3B、MHCC97h细胞活力的影响 |
| 3.3 岩藻黄质对人肝癌细胞Hep3B、MHCC97h克隆形成的影响 |
| 3.4 岩藻黄质对细胞周期的影响 |
| 3.5 岩藻黄质对细胞凋亡的影响 |
| 4 小结 |
| 第三部分 蛋白质组学分析 |
| 第一节 岩藻黄质对人肝癌细胞Hep3B作用差异蛋白组学的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 蛋白提取 |
| 2.2 Bradford法蛋白定量 |
| 2.3 蛋白酶解 |
| 2.4 iTRAQ标记 |
| 2.5 高pH条件下的反相色谱分离 |
| 2.6 纳升级反相色谱-Q Exactive进行蛋白质分析 |
| 2.7 质谱数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 SDS-PAGE电泳 |
| 3.2 蛋白质定性结果 |
| 3.3 蛋白质定量结果 |
| 3.4 鉴定结果的评估 |
| 3.5 鉴定结果的总体分析和差异蛋白筛选 |
| 3.6 功能注释和分析 |
| 第二节 关键差异蛋白验证 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 配制试剂 |
| 2.2 细胞总蛋白的提取 |
| 2.3 蛋白含量测定 |
| 2.4 免疫印迹试验 |
| 3 结果 |
| 4 小结 |
| 讨论 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 文献综述 岩藻黄质抗肿瘤作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录2 博士期间发表论文 |
（7）HBx上调的LncRNA TRERNA1在促进肝细胞癌进展及预后不良中作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 肝癌临床病例组织 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 菌株及表达质粒载体 |
| 1.5 小干扰RNA |
| 1.6 质粒扩大及培养 |
| 1.7 细胞培养及转染 |
| 1.8 RNA提取,cDNA逆转录及real-time PCR |
| 1.9 引物合成 |
| 1.10 Western blot试剂 |
| 1.11 细胞增殖试剂 |
| 1.12 细胞周期试剂 |
| 1.13 IP(免疫共沉淀) |
| 1.14 RIP(RNA免疫沉淀)试剂 |
| 1.15 ChIP(染色质免疫共沉淀)试剂 |
| 1.16 细胞核质分离试剂 |
| 2.主要耗材和仪器 |
| 3.方法 |
| 3.1 过表达基因及干扰基因表达载体的构建 |
| 3.2 细胞培养及转染 |
| 3.3 肝癌细胞和组织RNA的提取 |
| 3.4 逆转录反应 |
| 3.5 Real time quantitative RT-PCR(qPCR) |
| 3.6 Western blot检测目的基因的蛋白表达 |
| 3.7 细胞划痕法实验 |
| 3.8 Transwell细胞迁移实验 |
| 3.9 Transwell细胞侵袭实验 |
| 3.10 CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测细胞增殖能力 |
| 3.11 平板克隆形成实验 |
| 3.12 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 3.13 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 3.14 体内异种移植裸鼠尾静脉注射转移模型 |
| 3.15 RIP(RNA Immunoprecipitation,RIP)实验 |
| 3.16 ChIP实验 |
| 3.17 核质分离 |
| 3.18 免疫沉淀反应(IP) |
| 第二章 实验结果 |
| 第一节 LncRNA TRERNA1与HBV的 HBx表达水平相关性分析 |
| 引言 |
| 结果 |
| 1.1 HBx诱导HCC细胞中lncRNA的差异表达谱分析 |
| 1.2 HCC细胞中lncRNA TRERNA1 的表达水平受HBx表达影响 |
| 1.3 HCC病例组织中HBx与 TRERNA1 的表达水平呈正相关 |
| 小结 |
| 第二节 高表达TRERNA1 促进HCC细胞侵袭转移能力作用机制的研究 |
| 引言 |
| 结果 |
| 2.1 TRERNA1 的异常高表达与HCC的转移相关 |
| 2.2 体外实验研究TRERNA1 高表达对HCC细胞的迁移和侵袭能力的影响 |
| 2.3 体内实验研究TRERNA1 对裸鼠HCC细胞转移及肝转移结节的形成 |
| 2.4 TRERNA1 负调节肿瘤转移抑制因子CDH1 的表达 |
| 2.5 TRERNA1 通过结合EHMT2 抑制CDH1 的表达 |
| 2.6 TRERNA1 招募EHMT2使CDH1 启动子区发生H3K9 二甲基化 |
| 2.7 TRERNA1 招募EHMT2与SNAI1 形成复合物抑制CDH1 的表达 |
| 2.8 TRERNA1 增强了SNAI促进HCC细胞的转移能力 |
| 2.9 TRERNA1 作为增强子样lncRNA调节SNAI1 的表达 |
| 2.10 HCC中 TRERNA1和CDH1 的表达水平之间呈负相关关系 |
| 2.11 TRERNA1 影响实验小鼠肝脏组织中Cdh1和Snai1 基因的表达水平 |
| 小结 |
| 第三节 TRERNA1 促进HCC细胞增殖能力机制的研究 |
| 引言 |
| 结果 |
| 3.1 高表达TRERNA1的HCC患者预后不良 |
| 3.2 TRERNA1 可能调控的基因与细胞增殖、细胞周期等生物学过程相关 |
| 3.3 TRERNA1 促进了HCC细胞的增殖和克隆形成能力 |
| 3.4 TRERNA1 促进了HCC细胞细胞周期G1/S期的转换 |
| 3.5 TRERNA1 促进了实验裸鼠HCC移植瘤的生长 |
| 3.6 TRERNA1 可能参与了HCC细胞中Raf-MAPK信号通路的激活 |
| 小结 |
| 第四节 TRERNA1 的高表达影响了HCC细胞对索拉非尼治疗敏感性 |
| 引言 |
| 结果 |
| 4.1 TRERNA1 影响HCC细胞中索拉菲尼的敏感性 |
| 4.2 受 HBx调控的高表达的TRERNA1 降低了索拉非尼对HCC细胞的敏感性 |
| 4.3 TRERNA1 促进了Raf-MEK-ERK的磷酸化信号通路的激活 |
| 小结 |
| 第三章 全文讨论 |
| 存在的问题与今后的展望 |
| 结论 |
| 第四章 文献综述 长链非编码RNA 肝癌中的研究动态及诊疗意义 |
| 前言 |
| 1. 长链非编码RNA的简介 |
| 2. LncRNA发挥功能的研究 |
| 3. LncRNA参与调控机制的研究 |
| 4. HCC中的LncRNA |
| 5. LncRNA在肝癌临床中的应用价值 |
| 6. 前景与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表研究论文情况 |
（8）第一部分 LKB1在结直肠癌中的功能研究第二部分 剪接异构体CHK1-S在肝癌中的作用及其临床意义（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 第一部分 LKB1在结直肠癌中的功能研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 1 LKB1的敲除不显着影响结直肠癌细胞的增殖 |
| 1.1 稳定细胞系的构建 |
| 1.2 LKB1的敲除对结直肠癌细胞增殖能力的影响不明显 |
| 1.3 LKB1的肠道特异敲除不影响AOM/DSS诱导小鼠的成瘤数 |
| 2 LKB1的敲除增强结直肠癌细胞的转移能力 |
| 2.1 LKB1的敲除增强HCT116结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力 |
| 2.2 LKB1的敲除增强SW480结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力 |
| 2.3 LKB1的敲除增强HCT116结直肠癌细胞小鼠体内肺转移能力 |
| 2.4 LKB1影响结直肠癌细胞EMT的变化 |
| 2.5 LKB1的敲除促进结直肠癌细胞分泌降解基质的酶 |
| 3 LKB1调控TNIK的表达 |
| 3.1 LKB1调控TNIK的表达 |
| 3.2 AOM/DSS诱导的LKB1敲除小鼠的大肠组织中TNIK的蛋白上调表达 |
| 3.3 LKB1的激酶活性参与调控TNIK的表达 |
| 4 LKB1通过调控TNIK的表达影响结直肠癌细胞的转移能力 |
| 4.1 敲降TNIK抑制RKO结直肠癌细胞的迁移和侵袭 |
| 4.2 敲降TNIK抑制HCT116结直肠癌细胞的迁移和侵袭 |
| 4.3 LKB1通过调控TNIK的表达调控结直肠癌细胞的迁移能力 |
| 4.4 LKB1通过调控TNIK的表达影响结直肠癌细胞的侵袭能力 |
| 4.5 LKB1通过调控TNIK的表达影响结直肠癌细胞在小鼠体内肺转移能力 |
| 5 TNIK调控细胞骨架 |
| 5.1 TNIK与ARHGAP29相互作用 |
| 5.2 TNIK促进细胞骨架重塑 |
| 5.3 TNIK促进伪足的形成 |
| 6 LKB1的敲除促进结直肠癌细胞移植瘤的微血管生成 |
| 7 LKB1的敲除影响结直肠癌细胞条件培养基对巨噬细胞极性的诱导 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 剪接异构体CHK1-S在肝癌中的作用及其临床意义 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 1 生物信息学分析肝癌中基因剪接异构体差异 |
| 2 CHK1-S在肝癌组织中高表达且高剪接比率与患者术后的预后相关 |
| 3 CHK1-S促肝癌细胞增殖的能力强于CHK1-L |
| 4 SRPK1参与调控CHK1-S的剪接 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 资助基金 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）抑癌因子ARID2和TPI1在肝癌发生和发展过程中的功能及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 ARID2在肝癌转移中的功能和机制研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 肝癌概况 |
| 1.1.2 肝癌诱因 |
| 1.1.3 肝癌治疗现状 |
| 1.1.4 肿瘤的特征 |
| 1.1.5 EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)与转移 |
| 1.1.6 MicroRNA |
| 1.1.7 表观遗传 |
| 1.1.8 SWI/SNF复合物 |
| 1.1.9 ARID2 |
| 1.2 研究目的和意义 |
| 1.3 材料方法 |
| 1.3.1 实验材料 |
| 1.3.2 实验动物 |
| 1.3.3 实验方法 |
| 1.3.4 统计分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 ARID2在肝癌组织中的表达情况,以及与临床病理信息之间的关系 |
| 1.4.2 ARID2抑制肝癌细胞体外转移 |
| 1.4.3 ARID2抑制肝癌细胞体内转移 |
| 1.4.4 敲除ARID2促进小鼠原发肝癌的转移 |
| 1.4.5 ARID2调控EMT因子的表达、microRNA的转录以及组蛋白修饰 |
| 1.4.6 实验结果总结 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 研究结论 |
| 1.7 主要创新点 |
| 第二章 TPI1在肝癌细胞生长、迁移和侵袭中的功能及其机制 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 肿瘤与代谢 |
| 2.1.2 肿瘤代谢特征 |
| 2.1.3 糖酵解 |
| 2.1.4 EMT与转移 |
| 2.1.5 细胞周期 |
| 2.1.6 周期蛋白D(CyclinD) |
| 2.1.7 P53 |
| 2.1.8 P27 |
| 2.1.9 β-catenin |
| 2.1.10 TPI1 |
| 2.2 研究目的和意义 |
| 2.3 材料方法 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验方法 |
| 2.3.3 数据分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 TPI1在肝癌组织中的表达情况 |
| 2.4.2 TPI1表达与肝癌患者术后预后情况正相关 |
| 2.4.3 TPI1表达与肝癌患者病理特征之间的关系 |
| 2.4.4 过表达TPI1抑制肝癌细胞的体外生长、迁移和侵袭 |
| 2.4.5 干扰TPI1基因的表达促进肝癌细胞的体外生长、迁移和侵袭 |
| 2.4.6 TPI1诱导肝癌细胞发生周期停滞 |
| 2.4.7 TPI1对周期、EMT相关因子表达的影响 |
| 2.4.8 TPI1抑制肝癌细胞的皮下成瘤能力 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 研究结论 |
| 2.7 主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表论文 |
| 附录 缩写与注解 |
（10）灰树花多糖联合维生素C诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡与自噬的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 缩略词表Ⅰ 缩略词表Ⅱ 缩略词表Ⅲ 第一章 前言 |
| 一、研究背景 |
| 1.1 肝癌的研究现状 |
| 1.2 中药及植物提取物在肝癌治疗中的应用 |
| 1.3 灰树花多糖抗肿瘤研究进展 |
| 1.4 灰树花多糖抑瘤效应的机制研究 |
| 二、研究目的 |
| 三、研究内容 |
| 四、研究方法 |
| 五、技术路线 |
| 参考文献 第二章 灰树花多糖抗肿瘤研究的文献计量学分析 |
| 一、研究背景 |
| 二、方法 |
| 2.1 数据获取 |
| 2.2 数据处理及软件分析 |
| 2.3 技术路线 |
| 三、结果 |
| 3.1 历年发文数量 |
| 3.2 频次最高的前20位关键词 |
| 3.3 关键词网络关系分析 |
| 3.4 发文最多的前10位期刊 |
| 3.5 作者合作网络分析 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 第三章 灰树花多糖抑瘤效应中凋亡作用的Meta分析 |
| 一、资料和方法 |
| 1.1 文献检索 |
| 1.2 文献筛选 |
| 1.3 数据提取 |
| 1.4 软件分析 |
| 1.5 技术路线 |
| 二、结果 |
| 2.1 文献筛选结果 |
| 2.2 纳入文献的基本情况 |
| 2.3 Meta分析结果 |
| 2.4 灰树花多糖对正常细胞增殖的影响 |
| 2.5 纳入文献中凋亡相关蛋白表达情况 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 参考文献 第四章 灰树花多糖联合维生素C对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 灰树花多糖的提取与检测 |
| 2.2 SMMC-7721细胞的培养 |
| 2.3 MTT法检测GFP与VC对SMMC-7721细胞增殖的影响 |
| 2.4 等效线图解法分析 |
| 2.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率 |
| 2.6 流式细胞分析仪检测细胞周期 |
| 2.7 统计学分析 |
| 2.8 技术路线 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 提取出的灰树花多糖含量检测结果 |
| 3.2 MTT法检测结果 |
| 3.3 等效线图解法分析结果 |
| 3.4 细胞凋亡率检测结果 |
| 3.5 细胞周期检测结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 第五章 灰树花多糖联合维生素C诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡和自噬的分子机制 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 主要试剂与材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂的配制 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 用药后细胞形态学观察 |
| 2.3 细胞凋亡荧光染色 |
| 2.4 MDC染色检测 |
| 2.5 凋亡相关蛋白表达 |
| 2.6 相关自噬蛋白表达 |
| 2.7 内参蛋白Western Blotting实验 |
| 2.8 Caspase活性检测 |
| 2.9 统计学分析 |
| 2.10 技术路线 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 药物处理后细胞形态观察 |
| 3.2 Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡 |
| 3.3 MDC染色观察药物处理后细胞中自噬泡 |
| 3.4 Bcl-2、Bax、PAPR、细胞色素C蛋白表达 |
| 3.5 caspase 活性检测 |
| 3.6 Beclin-1、LC3、Akt、p-Akt蛋白表达 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 参考文献 第六章 结论 |
| 一、主要结论 |
| 二、特色与创新 |
| 三、局限性与不足 |
| 四、研究展望 在学期间的研究成果 致谢 |
四、反义甲基转移酶基因片段增强肿瘤坏死因子相关凋亡诱导对肝癌细胞的作用（论文参考文献）
- [1]LINC13及ACTR分别调控氧化应激及糖酵解介导肝癌耐药的机制研究[D]. 马路园. 河北医科大学, 2021(02)
- [2]肝癌和癌栓的全基因组甲基化分析及差异基因的相关临床特征研究[D]. 樊潇霄. 浙江大学, 2020(01)
- [3]LncRNA HOTAIR调控通路遗传变异与肝癌易感性关联研究[D]. 刘桂炎. 广东药科大学, 2020
- [4]肿瘤响应纳米药物构建及个体化miRNA鸡尾酒疗法治疗肝癌[D]. 邵世怡. 浙江大学, 2020(01)
- [5]Six2介导E-cadherin导致肝癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的机制研究[D]. 李建旺. 南方医科大学, 2019(02)
- [6]海藻玉壶汤及其活性成分岩藻黄质对肝癌的影响[D]. 张欢欢. 上海中医药大学, 2019(03)
- [7]HBx上调的LncRNA TRERNA1在促进肝细胞癌进展及预后不良中作用机制研究[D]. 宋伟. 东南大学, 2019
- [8]第一部分 LKB1在结直肠癌中的功能研究第二部分 剪接异构体CHK1-S在肝癌中的作用及其临床意义[D]. 胡光辉. 北京协和医学院, 2019
- [9]抑癌因子ARID2和TPI1在肝癌发生和发展过程中的功能及其机制研究[D]. 姜浩. 华东理工大学, 2017(05)
- [10]灰树花多糖联合维生素C诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡与自噬的研究[D]. 赵霏. 兰州大学, 2016(08)
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