一、肾素-血管紧张素系统对肾纤维化的作用研究进展（论文文献综述）
张凯敏[1]（2021）在《基于NLRP3炎症小体信号通路探讨“浊毒致瘀”病机下的高血压肾病机制》文中提出目的:在“浊毒致瘀”病机下的高血压肾病的进展中,肾纤维化是一种常见的表型。其中TGF-beta在高血压肾纤维化的发病机制中发挥重要作用,NLRP3炎症小体在“浊毒致瘀”病机下的高血压肾病中扮演着重要的角色。然而,TGF-β介导的NLRP3炎症小体通路的激活在调节“浊毒致瘀”病机下的高血压肾纤维化中的病理生理作用尚未阐明。本研究旨在探讨TGF-β介导的NLRP3炎性小体在高血压大鼠肾纤维化中的作用,同时使用中药网络药理方法初步探讨中药黄芪治疗“浊毒致瘀”病机下引起的肾纤维化的通路与机制。方法:（1）“浊毒致瘀”病机下高血压肾纤维化模型的建立:将12只SD大鼠随机分为两组,即正常组和AngⅡ模型组。通过Alzet渗透微型泵,在单侧肾切除大鼠皮下埋置血管紧张素Ⅱ泵。每天观察动物的状态,14天后进行体重和血压的测量,开始取材。取肾脏置于4%多聚甲醛中固定,免疫组化检测肾脏中纤维化指标alpha-SMA,MMP-2,MMP-9以及促纤维化因子TGF-beta的表达情况。（2）探究肾纤维化过程中NLRP3炎症小体的作用:免疫组化技术检测肾脏中NLRP3炎症小体相关蛋白及下游高迁移率族蛋白（HMGB1）、IL-1beta的蛋白变化情况。利用TGF-beta（5ng/ml,1Ong/ml）刺激大鼠肾小管上皮细胞模拟纤维化模型。用不同浓度的TGF-beta刺激大鼠肾小管上皮细胞24小时,48小时,72小时检测alpha-SMA和Collagen Ⅰ的表达情况筛选药物刺激时间。使用DCFH-DA探针检测细胞内ROS的水平变化;免疫荧光检测TGF-beta刺激后NRK-52E细胞中NLRP3/Caspasel的共定位情况;Westernblot检测造模后NLRP3,Caspase1,cle-caspase1,HMGB1,GasderminD,cle-GasderminD 的表达情况;使用gRNA在NRK-52E细胞中沉默NLRP3后检测纤维化指标alpha-SMA的变化情况;使用Caspase1抑制剂AV-YVAD-CMK处理细胞后,检测纤维化指标alpha-SMA的变化情况;使用NLRP3炎症小体抑制剂ISO处理细胞后,检测纤维化指标 alpha-SMA,CollagenⅠ,以及 NLRP3 下游蛋白 HMGB1,GasderminD的变化情况,确定炎症小体活化后所激活的HMGB1-Gasdermin D轴与纤维化的发生发展密切相关。（3）利用中药网络药理学探究黄芪治疗肾纤维化的作用机制:通过TCMSP数据库可以得到黄芪有效成分以及对应的靶点信息;使用SwissTargetPrediction数据库进行靶点预测;使用Genecards综合数据库收集肾纤维化相关靶点信息;应用在线韦恩图绘制工具Jvenn,获得肾纤维化相关的靶点以及黄芪活性成分靶点的交集;将黄芪活性成分与肾纤维化的共有靶点输入String数据库构建PPI网络;将黄芪活性成分与肾纤维化的共有靶点进行GO富集和KEGG通路分析。结果:（1）Ang Ⅱ造模14天后,与对照组相比,大鼠的体重无明显变化,造模组大鼠的血压明显增升高。对肾组织切片进行免疫组化检测,结果显示Ang Ⅱ造模后大鼠肾脏中纤维化指标alpha-SMA,MMP-2,MMP-9明显增加,证明高血压肾纤维化模型造模成功。免疫组化的结果同时显示Ang Ⅱ造模后大鼠肾脏中的TGF-beta的含量增加了,证明TGF-beta与Ang Ⅱ的促纤维化作用密切相关。（2）探究肾纤维化过程中NLRP3炎症小体的作用:免疫组化结果显示造模大鼠肾脏中NLRP3炎症小体相关蛋白及下游HMGB1、IL-1beta的蛋白表达量增加,表明NLRP3炎症小体可能参与着肾纤维化的发生发展过程。Westernblot结果显示TGF-beta刺激大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E 72小时后,alpha-SMA和Collagen Ⅰ的表达明显增加。使用荧光酶标仪检测不同浓度TGF-beta刺激后,大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E中ROS的水平变化,结果显示TGF-beta刺激可以显着增加细胞中ROS的水平。免疫荧光结果表示,TGF-beta可以增强大鼠肾小管上皮细胞中NLRP3/Caspase1的共定位情况。Western Blot检测TGF-beta刺激后大鼠肾小管上皮细胞NLRP3,Caspase1,cle-caspase1,HMGB1,GasderminD,cle-GasderminD的表达情况,结果显示TGF-beta刺激可以上调NLRP3,cle-Caspase1,cle-GasderminD的蛋白表达以及促进细胞上清液中的HMGB1的含量增加。使用gRNA在NRK-52E细胞中沉默NLRP3以及使用Caspase1抑制剂AV-YVAD-CMK处理细胞,检测纤维化指标alpha-SMA的变化情况,结果显示沉默了 NLRP3以及抑制了 Caspase1后,TGF-beta无法上调纤维化指标alpha-SMA的表达。使用NLRP3炎症小体抑制剂ISO处理细胞后,Westernblot结果显示TGF-beta无法增加纤维化指标alpha-SMA和Collagen I的表达,细胞上清液中的HMGB1的含量没有明显变化,以及TGF-beta无法刺激细胞中cle-GasderminD的表达增加。（3）利用中药网络药理学探究黄芪治疗肾纤维化的作用机制:通过TCMSP数据库筛选得到黄芪的活性成分24个,靶点238个;使用Genecards综合数据库收集肾纤维化相关靶点信息5609个,筛选出前1500个靶点进行下一步操作。应用在线韦恩图绘制工具Jvenn将238个黄芪的活性成分靶点和1500个肾纤维化靶点的进行映射后得到黄芪活性成分与肾纤维化的共同靶点109个;“黄芪活性成分-肾纤维化-靶点”网络的结果显示槲皮素,山柰酚,刺芒柄花素可能是黄芪治疗肾纤维化发挥药效的主要成分。PTSG2,PTSG1,PRSS1,NOS2,NOS3,AR,DPP4,ADRB2,SCN5A,ESR1,PIK3CG可能是黄芪治疗肾纤维化的作用靶点。GO功能总共富集到2271条生物过程,129项分子功能相关,46项细胞组成相关;KEGG通路分析总共富集的得到150条信号通路。结论:（1）Ang Ⅱ造模成功建立了“浊毒致瘀”病机下高血压肾纤维化模型。（2）TGF-beta可以诱导NLRP3炎症小体的活化导致HMGB1从孔道蛋白GasderminD释放到细胞外起促纤维化作用。抑制NLRP3炎症小体的活化可以有效抑制TGF-beta介导的纤维化作用（3）中药网络药理学证明黄芪治疗肾纤维化的作用具有多成分,多靶点,多通路的特点。
刘静茹[2]（2021）在《利水渗湿中药通过调控RAS改善慢性肾损伤的机制研究》文中研究说明肾纤维化是各种慢性肾脏病发展至终末期肾脏病的共同途径和主要病理特征。转化生长因子-β1（TGF-β1）等生长因子、单核细胞趋化蛋白等趋化因子及肾素-血管紧张素系统（RAS）、TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin等通路参与肾纤维化的发生与发展。RAS由肾素、血管紧张素原、血管紧张素I、血管紧张素转换酶、血管紧张素II（Ang II）、血管紧张素受体等六大成分组成,广泛的研究证明激活的肾内RAS参与肾纤维化。茯苓皮、猪苓、泽泻等利水渗湿中药具有肾保护作用。基于我们之前的研究,本研究探讨从茯苓皮、猪苓和泽泻分离茯苓酸ZA（PZA）、茯苓酸B（PAB）、麦角甾酮（Ergone,ERG）和23-乙酰泽泻醇B（ABA）对RAS、TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin信号通路的影响,揭示其抗肾纤维化的机制。目的:1.探讨PZA通过介导TGF-β1或AngⅡ处理激活的RAS和TGF-β1/Smad信号通路改善人近端小管上皮细胞（HK-2）和足细胞（MPC5）损伤的作用机制,揭示其肾保护作用的机制。2.探讨PAB、ERG和ABA通过介导AngⅡ处理激活的RAS和Wnt/β-catenin信号通路改善HK-2细胞和MPC5细胞损伤的作用机制,揭示其肾保护作用的机制。方法:1.茯苓皮、猪苓、泽泻药材粉碎,采用甲醇、乙醇等提取,石油醚、乙酸乙酯等萃取,硅胶、葡聚糖凝胶等柱色谱分离,半制备高效液相色谱纯化等,利用高分辨质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱等进行结构鉴定分离得PZA、PAB、ERG和ABA。2.利用qRT-PCR、siRNA、免疫荧光染色、免疫共沉淀和Western blots等方法,研究PZA对TGF-β1或AngⅡ诱导的HK-2细胞和MPC5细胞中细胞外基质成分、RAS、TGF-β1/Smad通路的影响。3.利用qRT-PCR、免疫荧光染色、Western Blots等方法,研究PAB,ERG和ABA对AngⅡ诱导的HK-2细胞和MPC5细胞中RAS、Wnt/β-catenin、IκB/NF-κB和Keap1/Nrf2信号通路的影响。结果:1.通过高分辨质谱、1H NMR,13C NMR等方法分析鉴定得PZA、PAB、ABA和ERG。2.PZA处理抑制TGF-β1或AngⅡ诱导的HK-2细胞和MPC5细胞中RAS成分AGT、Renin、ACE和AT1蛋白表达显着增加,表明PZA对RAS活化具有干预作用;抑制促纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白、纤连蛋白等表达上调,E-cadherin表达下调,表明PZA对细胞外基质成分的过度沉积具有改善作用;抑制TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、Smad4蛋白表达显着上调及Smad7蛋白显着下调,表明PZA对TGF-β1/Smad信号通路的活化具有调控作用。3.AngⅡ诱导的HK-2细胞和MPC5细胞中RAS成分AGT、Renin、ACE和AT1蛋白表达上调及Wnt/β-catenin信号通路中Wnt1、Activeβ-catenin和β-catenin蛋白表达上调;β-catenin抑制剂ICG-001处理可抑制RAS成分表达上调,同时,AngⅡ1型受体阻断剂氯沙坦（LOS）可抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化,表明RAS与Wnt/β-catenin信号通路存在相互作用;AngⅡ诱导的HK-2细胞促纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白、纤连蛋白等表达上调,E-cadherin表达下调,说明AngⅡ导致细胞外基质成分过度沉积;AngⅡ诱导的MPC5细胞中podocin、nephrin、podocalyxin、synaptopodin等蛋白表达显着下调,表明AngⅡ导致足细胞损伤;同时,AngⅡ诱导的HK-2细胞和MPC5细胞中Wnt1、Activeβ-catenin和β-catenin及其下游靶蛋白Snail1、Twist、基质金属蛋白酶-7（MMP-7）、成纤维细胞特异性蛋白1（FSP-1等）蛋白表达上调,表明RAS激活了Wnt/β-catenin信号通路;AngⅡ诱导的HK-2细胞和MPC5细胞中MCP-1、COX-2蛋白表达显着上调及Nrf-2、HO-1蛋白表达显着下调,表明RAS激活了IκB/NF-κB和Keap1/Nrf2信号通路。PAB、ABA和ERG处理对HK-2细胞和MPC5细胞中中的RAS、Wnt/β-catenin、IκB/NF-κB和Keap1/Nrf2信号通路具有调控作用。结论:茯苓皮、猪苓、泽泻中的活性成分PZA、PAB、ABA和ERG具有改善肾损伤的作用,分别通过调控RAS、TGF-β1/Smad、Wnt/β-catenin、IκB/NF-κB和Keap1/Nrf2信号通路发挥肾保护的作用,研究揭示了这三种利水渗湿中药改善肾损伤的机制。
杨洁珂[3]（2021）在《原儿茶醛抑制lncRNA9884介导的炎症以改善肾脏纤维化的研究》文中研究表明目的:慢性肾脏病（CKD）及其引起的终末期肾病（ESRD）是危害人类健康的主要疾病之一,其发病率高、并发症多,已经成为引起全球性关注的公共健康问题,给家庭和社会造成了巨大的经济负担。根据美国肾脏数据系统（USRDS）2019年的年报,目前CKD在全球一般人群患病率约为14.5%,其中每100名患者中就有三分之二的病人会发展为不可逆的肾功能衰竭,需要引起广泛的重视。然而目前慢性肾脏病的防治手段较为局限,口服药物和替代治疗方法的选择面都很狭窄,且费用昂贵,亟需开发新药或者新的治疗手段来降低患者治疗成本并有效缓解疾病的进展。长久以来,我国多年来的深厚中医文化底蕴沉淀出了许多对于慢性肾病有效的经方,但因其中药成分繁多,治疗机制复杂难辨,难以形成国际认可并统一的治疗准则。亟待我们深入挖掘其中的小分子成分并探索研究其具体的分子机制。本研究通过构建单侧输尿管阻塞（UUO）诱导的小鼠体内纤维化及炎症的模型和体外提取原代肾小管上皮细胞（TECs）使用TGF-β1诱导刺激纤维化以及IL-1β诱导刺激炎症模型,使用血清肾功能检测、组织切片病理染色、Western Blot、Real-time PCR、ELISA、CCK8毒性分析、免疫组织化学染色和免疫荧光标记、过表达质粒等实验方法和指标,旨在探讨中草药丹参的主要单体成分原儿茶醛（PCA）治疗梗阻性肾病的作用,以及调控lnc RNA9884（LRNA9884）发挥抗炎和抗纤维化的潜在分子机制。方法:首先建立体内SPF级C57BL/6小鼠的梗阻性肾病UUO模型,30只雄性小鼠被随机分为假手术组（Sham组）、梗阻性肾病模型组（UUO组）、低剂量原儿茶醛治疗组（10 mg/kg/d PCA,UUO+PCA 10）和高剂量原儿茶醛治疗组（40 mg/kg/d PCA,UUO+PCA 40）。PCA治疗组手术前腹腔注射给药一次,之后连续注射7天,每日一次,其余各组小鼠每日给予等体积生理盐水腹腔注射。7日之后,麻醉小鼠心脏采血并处死小鼠收集血清和处理肾脏用于开展实验。检测小鼠血清肌酐、尿素氮肾功能指标,组织切片行HE、Masson染色观察肾脏病理学改变情况;免疫组化、免疫荧光或者蛋白印迹,realtime-PCR检测α-SMA、Fibronectin、Smad3、NF-κB、Collagen I及MCP-1、i NOS、COX-2、IL-1β、TNF-α和IL-6的表达;利用realtime-PCR检测LRNA9884表达情况;ELISA测定血清中促炎细胞因子IL-1β,TNF-α和IL-6的分泌情况。在体外利用TECs分别建立IL-1β刺激诱导的细胞炎症模型和TGF-β1刺激诱导的细胞纤维化模型,并同时予以PCA不同浓度治疗组（20μM,40μM,80μM）一同处理24小时后,收集细胞上清和细胞,并及时提取蛋白、RNA冻存用于后续的实验。免疫荧光染色近端肾小管标志物AQP1、CK18以检测所提取TECs细胞纯度;CCK-8检测不同浓度PCA干预后的细胞活力并筛选出适宜浓度作为体外治疗的剂量;利用蛋白印迹,realtime-PCR实验方法检测各组细胞中α-SMA,Fibronectin,Collagen I,Smad3,NF-κB及MCP-1,i NOS,COX2,TNF-α和IL-6的表达;通过realtime-PCR检测各组细胞中LRNA9884的表达情况;ELISA测定细胞上清液中促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌情况;进一步通过体外转染pc DNA3.1-LRNA9884质粒在TECs中过表达LRNA9884,检测上述指标的变化情况。结果:通过血清肌酐、尿素氮的检测结果以及观察组织切片HE染色情况我们发现予以PCA治疗可部分逆转UUO引起的肾功能不全和病理改变。Masson染色及纤维化代表指标α-SMA,Fibronectin,Collagen I蛋白和m RNA水平realtime-PCR检测发现予以PCA治疗可显着减轻UUO所引起的纤维沉积。通过免疫荧光、蛋白印迹,realtime-PCR以及ELISA检测发现PCA干预后在蛋白和m RNA水平上均降低了UUO所引起的炎症细胞因子的过度表达。进一步检测发现PCA降低了NF-κB和Smad3通路的活化以及LRNA9884的表达。根据CCK-8检测结果筛选出药物适宜治疗浓度（20μM,40μM,80μM）,通过蛋白印迹,realtime-PCR检测发现PCA可以抑制IL-1β诱导的TECs中i NOS、COX2、MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-1β促炎细胞因子在蛋白和m RNA水平上的表达。ELISA检测细胞上清发现促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达同样被PCA干预后抑制。蛋白印迹检测进一步发现磷酸化的NF-κB激活受到抑制,realtime-PCR检测发现LRNA9884的表达在PCA干预后呈剂量依赖性下降,结果提示我们PCA的抗炎作用于调控LRNA9884有着密切关系。进一步通过转染pc DNA3.1-LRNA9884质粒在TECs中过表达LRNA9884时,上述指标在蛋白和m RNA水平上的表达均显着逆转,表明PCA的确可通过介导LRNA9884/MCP-1信号通路来抑制炎症反应。进一步使用PCA干预TGF-β1刺激的TECs,我们发现PCA能抑制TGF-β1诱导的纤维化模型中磷酸化的Smad3的活化,在蛋白和m RNA水平上均减轻纤维相关指标α-SMA,Fibronectin,Collagen I的表达,从而阻止上皮-间质转化（EMT）。结论:1.原儿茶醛可改善UUO小鼠肾功能损害,减轻肾小管的坏死。2.原儿茶醛在体内外均可抑制小鼠肾脏上皮-间质转化的发生和促炎因子的浸润。3.原儿茶醛可通过下调LRNA9884/MCP-1信号途径减轻炎症以改善肾间质纤维化。总之,原儿茶醛可通过抑制LRNA9884和NFκB信号途径引起的炎症反应以减轻阻塞性肾病的纤维化,研究结果为PCA在未来应用于临床治疗奠定了新的理论基础。
魏照晴[4]（2021）在《原发性高血压患者肾功能影响因素及中医证候相关性分析》文中指出目的:研究原发性高血压患者肾功能的影响因素及中医证候分布,初步探讨原发性高血压患者肾功能进展的危险因素及原发性高血压患者中医证候与肾功能的相关性,为高血压肾损害的中西医预防及诊治提供新思路。方法:通过回顾性研究,纳入2016年1月至2021年1月在北京中医药大学东直门医院肾病科住院的原发性高血压患者,收集患者临床数据资料,进行中医辨证分型,根据患者 eGFR（ml/（min.1.73m2））将患者分为 eGFR≥60 组和 eGFR<60 组,运用 spss26.0进行数据统计分析,比较两组间数据指标差异,分析eGFR与各因素相关性,运用线性回归分析原发性高血压患者肾功能进展的危险因素。结果:1.一般情况:本研究共纳入原发性高血压患者180例,其中男性102例,女性78例,年龄最小为23岁,年龄最大为90岁,平均年龄为58.73±16.54岁,高血压病程为0～60年不等;2.两组患者情况比较:eGFR≥60组和eGFR<60组两组间患者年龄、吸烟情况、BMI、高血压病程、SBP、NLR、血磷、血钙、血尿素、SUA、ALB、TBIL、HDL-C存在显着差异（p<0.05）。两组间性别、饮酒情况、冠心病、脑梗死、其他心脑血管疾病、高血压家族史、肾脏病家族史、DBP、PP、TC、TG差异无统计学意义（p>0.05）;3.中医证型分布情况:eGFR≥60组的四种证型中,阴虚阳亢证所占比例最高（28.4%）,其次为肝火亢盛证（26.1%）和痰湿壅盛证（26.1%）,阴阳两虚证所占比例最低（19.3%）;eGFR<60组中,痰湿壅盛证所占比例最高（40.2%）,其次为阴虚阳亢证（26.1%）和阴阳两虚证（26.1%）,肝火亢盛证所占比例最低（7.6%）。两组间证候分布存在显着差异,进一步分析发现eGFR≥60组肝火亢盛证显着多于GFR<60组,痰湿壅盛证显着少于eGFR<60组,差异具有统计学意义（p<0.05）;4.原发性高血压患者肾功能影响因素分析:BMI、血钙、ALB、TBIL、HDL-C与eGFR呈显着正相关（p<0.05）;年龄、高血压病程、SBP、PP、NLR、血磷、血尿素、SUA与eGFR呈显着负相关（p<0.05）;性别、吸烟、饮酒、DBP、冠心病、脑梗死、其他心脑血管疾病、高血压家族史、肾脏病家族史、TG、TC等与eGFR未见显着相关性（p>0.05）。肝火亢盛证与eGFR呈正相关关系,痰湿壅盛证与eGFR呈负相关关系,相关性显着（p<0.05）。阴虚阳亢证、阴阳两虚证与eGFR未见显着相关（p>0.05）。多因素回归分析发现,血磷、NLR、年龄、SUA、SBP、低ALB、低BMI可能是肾功能进展的独立危险因素。结论:1.原发性高血压患者肾功能异常的发病以老年人为主,不同性别的肾损害发生率未见显着差异,随着高血压病程的进展,肾损害的发生率逐渐增加;2.HDL-C、TBIL和血钙与原发性高血压患者的肾功能相关,但并非肾功能进展的独立危险因素;3.年龄、SBP、NLR、低BMI、低ALB、SUA及血磷可能是原发性高血压患者肾功能进展的独立危险因素。因此及早有效控制血压、合理低蛋白饮食、补充营养、降磷、降尿酸治疗对高血压患者肾功能是获益的;4.肝火亢盛证、痰湿壅盛证与原发性高血压患者的肾功能相关,肝火亢盛证与eGFR呈正相关,痰湿壅盛证与eGFR呈负相关,临床表现为痰湿壅盛证的高血压患者应警惕肾脏损害的发生。对于未发生肾损害的患者应滋补肝肾、顾护中焦,未病先防,而对于已经出现肾损害的患者,应当注重化痰通络、活血降浊法的应用。
黄娟[5]（2020）在《短期高盐饮食对不同年龄、性别C57BL/6J小鼠肾脏纤维化的影响及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨短期高盐饮食对不同年龄、性别C57BL/6J小鼠肾脏纤维化的影响及其可能的作用机制。方法:80只清洁级健康C57BL/6J小鼠,分为幼年组（6-8周龄）及成年组（16-18周龄）,每年龄段各40只,雌雄各半,分笼饲养,适应性喂养1周后,将各年龄段小鼠均随机分为雄鼠正常盐组（含0.5%NaCl饲料喂养,NS组）、雄鼠高盐组（含8%NaCl饲料喂养,HS组）、雌鼠NS组、雌鼠HS组,每组各10只。测小鼠尾动脉血压,1次/周,共3周。代谢笼收集各组小鼠24h尿液;3周测定血肌酐、血尿素氮、24h尿微量白蛋白（mALB）及24h尿钠、钾含量,计算24h尿钠/钾比;HE、PAS、Masson染色观察肾脏形态及纤维化。ELISA法检测小鼠血清雌激素、肾脏血管紧张素（1-7）[Angiotension（1-7）]含量;免疫组织化学法检测小鼠肾脏Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ,ColⅠ）、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ,Col Ⅲ）、肾脏损伤分子-1（Kidney damage molecules-1,Kim-1）、平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、波形蛋白（Vimentin）、E-钙粘蛋白（E-cadherin）、血管紧张素转换酶 2（Angiotensin converting enzyme 2,ACE2）、Mas 受体（MasR）、血管紧张素转换酶（Angiotensin converting enzyme,ACE）及血管紧张素 Ⅱ 1 型受体（Angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R）蛋白的分布;Western blotting 检测小鼠肾脏 Col Ⅰ、Col Ⅲ、Kim-1、α-SMA、Vimentin、E-cadherin、TGF-β1、p-Smad3、ACE2、MasR、ACE、Ang Ⅱ 及 AT1R 蛋白的表达。结果:（1）在幼年组（6-8w）C57BL/6J小鼠中:实验第3周各组间小鼠尾动脉收缩压比较差异均无统计学意义（P>0.05）;与同性别NS组小鼠比,HS组小鼠24h mALB、24h尿钠、24h尿钾及24h尿钠/钾比均升高（P<0.05）。与同性别NS组小鼠比,HS组小鼠肾小球硬化指数、肾小球纤维化指数及肾间质纤维化指数均升高（P<0.05）;与雄鼠HS相比,雌鼠HS组肾小球硬化指数、肾小球纤维化指数及肾间质纤维化指数均减少（P<0.05）。雌鼠血清雌激素含量均高于雄鼠。与同性别NS组比,HS组小鼠Ang（1-7）含量减少,COL Ⅰ、COLⅢ、Kim-1、α-SMA、Vimentin、TGF-β1、p-Smad3、ACE、Ang Ⅱ 及 AT1R 蛋白表达量增加（P<0.05）,E-cadherin、ACE2 及 MasR 蛋白表达量均减少（P<0.05）;与雄鼠HS组比,雌鼠HS组Ang（1-7）含量增多（P<0.05）,COLⅢ、Kim-1、ACE、Ang Ⅱ 及 AT1R 蛋白表达量减少（P<0.05）,ACE2 及 MasR 蛋白表达量增多（P<0.05）。（2）在成年组（16-18w）C57BL/6J小鼠中:实验第3周,与雄鼠NS组比,雄鼠HS组尾动脉收缩压升高（P<0.05）。与同性别NS组比,HS组小鼠血尿素氮、24h mALB、24h尿钠、24h尿钾及24h尿钠/钾均比升高（P<0.05）。与同性别NS组小鼠比,HS组小鼠肾小球硬化指数、肾小球纤维化指数及肾间质纤维化指数均升高（P<0.05）;与雄鼠HS相比,雌鼠HS组肾小球硬化指数、肾小球纤维化指数及肾间质纤维化指数均减少（P<0.05）。雌鼠血清雌激素含量均高于雄鼠。与同性别NS组比,HS 组小鼠 Ang（1-7）含量减少,COL Ⅰ、COL Ⅲ、Kim-1、α-SMA、Vimentin、TGF-β1、p-Smad3、ACE、Ang Ⅱ 及 AT1R 蛋白表达量增加（P<0.05）,E-cadherin、ACE2 及 MasR蛋白表达量均减少（P<0.05）;与雄鼠HS组比,雌鼠HS组Ang（1-7）含量增多（P<0.05）,COL Ⅰ、COL Ⅲ、Kim-1、α-SMA、Vimentin、TGF-β1、p-Smad3、ACE、Ang Ⅱ 及AT1R蛋白表达量减少（P<0.05）,E-cadherin,ACE2及MasR蛋白表达量增多（P<0.05）。结论:（1）短期高盐饮食可通过血压依赖途径或非血压依赖途径诱导C57BL/6J小鼠肾脏纤维化的发生;（2）肾小管-上皮间充质转化参与了短期高盐诱导C57BL/6J小鼠肾脏纤维化的病理过程;（3）TGF-β1/Smads通路和肾脏局部肾素-血管紧张素系统的激活参与短期高盐诱导C57BL/6J小鼠肾脏纤维化的发生机制;（4）短期高盐致小鼠肾脏纤维化的发生与其年龄和性别密切相关,以雄性、成年小鼠更加明显,其机制可能与雌鼠体内ACE2-Ang（1-7）-Mas受体轴的激活,抑制ACE-Ang Ⅱ-AT1R经典轴有关。
沙其朋[6]（2020）在《特发性膜性肾病肾小管间质病变与血瘀证的相关性研究》文中研究指明目的:研究特发性膜性肾病（IMN）肾小管间质病变与血瘀证的相关性,为IMN血瘀证的微观辨证提供参考标识,并探讨IMN患者肾小管间质病变的相关危险因素,以便及时干预。方法:收集自2019年04月至2019年12月于山东省立医院肾内科就诊的经肾脏活检病理确诊为IMN的患者176例。收集患者的一般情况、血瘀证积分、病理资料和实验室检查,应用SPSS 22.0对数据进行统计分析。结果:1.176例IMN患者以中老年为主,男女比例为1.26:1。2.176例患者在病理分期上全部为早期和Ⅱ期,并且全部伴有肾小管间质损伤,轻度病变（T1组）101例,中度病变（T2组）75例,无重度肾小管间质病变患者。T1组FSGS发病率明显低于T2组（P<0.01）。3.对176例IMN患者进行辨证分型,本虚证中以脾肾阳虚证、脾肾气虚证为主,脾肾阳虚组患者兼有血瘀证的比例偏高,差异具有统计学意义（P<0.05）。176例患者中兼有血瘀证的有155例,年龄>60岁的患者血瘀证积分明显高于1640岁和4160岁组（P<0.05）;病程>6月的患者血瘀积分明显高于病程在03月和36月的患者（P<0.05）。155例符合血瘀证诊断的IMN患者中,T2组的血瘀积分要明显高于T1组（P<0.01）。对患者肾小管间质病变积分与血瘀证积分行Spearman双变量相关性分析,结果显示Rs=0.461,P<0.01,两者具有正相关关系。4.临床特点分析:T2组合并高血压和糖尿病的比例明显高于T1组（P均<0.05）。T1组ALB、e GFR水平高于T2组（P<0.05）,PR/24h、Scr、TG、TC、LDL-C小于T2组（P<0.05）。Logistic回归分析发现高血压、糖尿病、伴有FSGS、ALB水平、Scr水平和24h尿蛋白定量是IMN患者肾小管间质病变加重的独立性危险因素。结论:1.IMN患者的年龄和病程与其血瘀程度密切相关;2.肾小管间质病变程度与血瘀程度存在正相关关系;3.肾小管间质病变可以考虑作为IMN患者血瘀证的微观辨证依据,为临床活血化瘀类药物的使用提供参考标识;4.高血压、糖尿病、病理伴有FSGS、大量蛋白尿、低蛋白血症,血肌酐升高是IMN患者肾小管间质病变加重的危险因素,临床上应该给予积极干预。
李燕[7]（2020）在《IRF-1通过抑制Klotho促进肾间质纤维化的机制研究》文中认为研究背景:肾间质纤维化是慢性肾脏病（CKD）的主要病理改变,其一旦发生将持续进展,最终导致终末期肾病（ESRD）的发生。但截至目前,肾间质纤维化的发生、发展机制仍未完全阐明,抗肾纤维化的治疗策略始终未能达到良好预期。因此,深入探讨肾间质纤维化的发生机理并寻找有效的干预措施具有极其重要的临床意义。炎症是肾纤维化发生和发展的一个重要始动因素。干扰素调节因子-1（Interferon regulator factor 1,IRF-1）是IRFs家族的主要成员,在多种成体细胞中均有表达,作为转录因子调控一系列靶基因转录,参与炎症损伤、免疫反应、肿瘤免疫监视及病毒感染等多种生理和病理过程。众所周知,免疫异常和炎症是许多肾脏疾病的关键致病机制。近年来,有研究发现ROS通过诱导IRF-1在受损的肾小管上皮细胞表达,进而导致促炎基因上调,以此加重缺血性急性肾损伤。在新生大鼠UUO模型中,IRF-1在梗阻侧肾脏的表达显着增加。值得关注的是,近期研究发现IRF-1和Klotho以反向作用参与了肾脏钙磷代谢的生理过程。在Janus激酶3（JAK3）敲除小鼠的肾脏中,Cyp27b1的转录水平显着升高,导致1,25（OH）2D3的产生增多,并发现这与JAK3敲除后肾脏IRF-1表达增加和Klotho表达下调有关。研究证实,肾脏IRF-1表达增加促进了Cyp27b1的表达和1,25（OH）2D3的产生,而Klotho则下调了Cyp27b1的表达,降低了1,25（OH）2D3合成。IRF-1的上调以及Klotho的减少提示IRF-1和Klotho之间可能存在负调控关系。Klotho主要在肾小管上皮细胞中高度表达,包括膜型和分泌型两种类型的编码蛋白,而膜Klotho蛋白的胞外段剪切后及分泌型Klotho蛋白可以进入血循环,被称为可溶性Klotho蛋白,可对多个器官和细胞发挥保护作用。近年来,Klotho被证实为重要的抑制肾纤维化的因子,可以显着抑制TGF-β、Wnt/β-catenin信号通路和RAS系统活化,从而改善单侧输尿管梗阻（UUO）或阿霉素肾病（ADR）模型的肾间质纤维化。我们既往也证实Klotho可以通过与FGF2竞争结合FGFR受体抑制FGF2信号通路活化,减轻肾小管上皮细胞转分化和成纤维细胞增殖与活化,进而改善肾间质纤维化。同时,研究发现,在CKD及肾间质纤维化发生时Klotho在肾脏的表达水平显着降低。因此,Klotho表达下降是肾间质纤维化发生、发展的重要环节。但迄今为止,人们并未阐明CKD时Klotho表达为什么会显着降低,而明确CKD时导致Klotho表达下调的关键分子机制可能是探寻肾间质纤维化有效干预措施的重要突破口。据此,我们推测,在CKD时IRF-1可能通过抑制Klotho表达,诱导肾小管上皮细胞分泌致纤维化因子,最终导致肾间质纤维化的发生和发展。为验证以上推论,本课题首先观察了CKD患者、单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction,UUO）和阿霉素肾病（Adriamycin nephropathy,ADR）模型小鼠肾小管上皮细胞IRF-1的表达变化,以及其与肾纤维化程度之间的相关性;随后利用体外研究,在体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）、人胚胎肾细胞293（HEK293）中研究IRF-1对肾小管上皮细胞纤维化标志物表达的影响,探讨其作用是否与调控Klotho表达有关,并阐明上、下游分子机制;最后利用IRF-1基因敲除(IRF-1-/-)小鼠和C57BL/6J小鼠分别制备UUO模型,C57BL/6J小鼠制备的UUO模型给予尾静脉注射抗TNF-α中和抗体,明确敲除或抑制IRF-1通过调控Klotho改善肾间质纤维化的作用。方法和结果:第一部分:IRF-1与肾间质纤维化的相关性研究1.CKD患者肾活检标本中IRF-1表达增加,与肾间质纤维化程度呈显着正相关:我校第二附属医院肾内科生物标本库选取肾活检标本中无明显肾脏病理改变的肾活检标本和有肾纤维化病变的CKD患者标本,分别进行Masson染色和IRF-1免疫组织化学染色,分析肾间质纤维化程度和IRF-1表达水平。结果显示,与正常肾组织相比,在CKD患者纤维化肾组织中,IRF-1在肾小管上皮细胞的表达显着增加,IRF-1的表达水平与肾间质纤维化面积呈显着正相关,而与eGFR值呈显着负相关。这些结果表明CKD患者肾组织中IRF-1的表达可能与肾间质纤维化的严重程度密切相关。2.UUO模型和阿霉素肾病（ADR）模型小鼠肾小管上皮细胞IRF-1的表达增加:野生型雄性C57BL/6小鼠32只,10-12周龄,分别制备UUO模型和ADR模型,造模后14天处死各实验组小鼠,肾脏取材。通过HE（Hematoxylin-eosin）、Masson、免疫组化染色和蛋白质免疫印迹法（Western blot,WB）检测肾脏损伤、肾纤维化程度和IRF-1表达情况。结果发现,UUO和ADR模型小鼠肾脏出现显着损伤和纤维化,并且肾近曲小管上皮细胞IRF-1表达显着增加。因此,在两种肾纤维动物模型中我们再次发现IRF-1可能与肾间质纤维化密切相关。3.IRF-1过表达显着促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达:构建人IRF-1质粒并转染体外培养人肾小管上皮细胞（HK-2）和大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E）,利用Western blot检测IRF-1、α-SMA和fibronectin的表达变化。结果发现,正常情况下,HK-2细胞和NRK52E细胞中IRF-1仅有微弱的表达;而IRF-1质粒转染导致细胞过表达IRF-1后,可以显着诱导纤维化标志物α-SMA和fibronectin的表达上调。以上结果表明,IRF-1过表达能够显着促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达。第二部分:IRF-1通过调控Klotho促进肾小管上皮细胞纤维化标志物表达的作用和机制研究1.CKD患者和UUO小鼠模型肾组织中Klotho表达降低,与IRF-1表达呈负相关:第一部分生物标本库中已选取的无明显肾脏病理改变的肾活检标本和有肾纤维化病变的CKD患者肾活检标本进行免疫组织化学染色,检测Klotho表达水平。结果显示,与正常肾组织相比,在CKD患者的纤维化肾组织中,肾小管上皮细胞Klotho表达显着减少,并与IRF-1表达呈显着负相关,这说明CKD患者肾组织中IRF-1表达升高可能与Klotho表达降低有着密切关联。野生型雄性C57BL/6小鼠32只,10-12周龄,UUO建模。建模后3天、7天和14天肾脏取材。利用Western blot、Real-time PCR和免疫荧光双染,检测IRF-1和Klotho在小鼠肾组织中的表达,及IRF-1和Klotho在肾小管上皮细胞的共定位情况。结果表明,在UUO模型组,梗阻侧肾小管上皮细胞IRF-1的表达增加伴随着Klotho的表达下调。以上结果表明,肾间质纤维化时IRF-1的高表达伴随着Klotho表达的显着降低,两者之间的是否存在调控关系值得深入探讨。2.IRF-1通过下调Klotho促进HK-2细胞纤维化标志物表达:IRF-1质粒转染至HK-2细胞,Western blot检测Klotho的表达变化,结果发现IRF-1过表达以剂量依赖性的方式抑制Klotho的表达。如果同时转染IRF-1和Klotho质粒,利用Western blot检测纤维化标志物α-SMA和fibronectin的表达变化,则发现Klotho过表达明显逆转了IRF-1质粒转染诱导的α-SMA和fibronectin表达,提示IRF-1通过抑制Klotho促进了肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达。3.IRF-1抑制Klotho基因转录体外培养人胚肾细胞（HEK293）,Western blot检测IRF-1的表达情况,结果表明,正常情况下,HEK293细胞中IRF-1仅有微弱的表达;而同时转染IRF-1质粒和Klotho启动子荧光素酶报告质粒（Klotho promoter reporter）,利用双萤光素酶报告基因试剂盒检测Klotho启动子荧光素酶活性的变化,发现IRF-1过表达以剂量依赖性的方式抑制Klotho（KL）启动子驱动的荧光素酶活性。利用JASPAR数据库预测出转录因子IRF-1在人Klotho启动子（包括Klotho转录起始位点上游4000bp）上存在13个潜在结合位点,分别设计引物,染色质免疫共沉淀法（ChIP）明确IRF-1是否直接结合到Klotho启动子区。结果发现,PCR产物均无明显阳性条带表达。提示IRF-1可以抑制Klotho基因转录,但并非直接与Klotho启动子区结合来调控其转录。4.IRF-1通过干扰C/EBP-β的活化下调HK-2细胞Klotho的表达为了探讨IRF-1抑制Klotho转录的机制,我们利用三个生物信息学数据库（PROMO、Genecards和JASPAR）分析人Klotho基因启动子,预测出可能与Klotho启动子区域结合（相对分数在80分以上）的11个转录因子,其中9个转录因子被报道参与了肾纤维化。为了明确介导IRF-1调控Klotho的转录因子,IRF-1质粒转染HK-2细胞后,Real-time PCR检测9个转录因子,即C/EBP-β、PPAR-γ、p53、SP1、YY1、USF2、C/EBP-α、GATA3和ATF3mRNA的表达变化。结果发现,IRF-1过表达显着抑制HK-2细胞中C/EBP-βmRNA表达水平（降低到三分之一）。Western blot检测发现IRF-1过表达以剂量依赖性的方式抑制C/EBP-β的蛋白表达。如果同时转染IRF-1和C/EBP-β质粒,利用Western blot检测Klotho、纤维化标志物α-SMA和fibronectin的表达变化,则发现C/EBP-β过表达明显逆转了IRF-1质粒转染诱导的Klotho表达下调及α-SMA和fibronectin的表达增高。此结果提示,IRF-1通过干扰C/EBP-β活化下调了Klotho的表达,进而促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达。5.C/EBP-β通过直接结合到Klotho启动子区域调控其转录构建一系列Klotho启动子荧光素酶报告质粒截短体KL5（-2000bp～+100bp）、KL4（-1705bp～+100bp）、KL3（-1530bp～+100bp）、KL2（-1220bp～+100bp）和KL1（-1000bp～+100bp）,分别与C/EBP-β质粒共转染到HEK293细胞。利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测Klotho启动子截短体荧光素酶活性的变化。结果发现,C/EBP-β过表达显着增强KL5、KL4、KL3和KL2驱动的荧光素酶活性,而对KL1和PGL3-Basic驱动的荧光素酶活性无影响。对Klotho启动子（KL2）中的第二个C/EBP-β结合位点进行了位点特异性突变,利用双荧光素酶报告基因试剂盒检测发现,C/EBP-β过表达对突变的KL2截短体驱动的荧光素酶活性没有影响。C/EBP-β质粒转染至HK-2细胞,染色质免疫沉淀（Ch IP）检测证实C/EBP-β可以直接结合到Klotho启动子中第2个C/EBP-β潜在结合位点的优势区域。以上结果表明,C/EBP-β能够直接结合到Klotho启动子区（-1039～-1029）调控其转录。6.TNF-α诱导HK-2细胞IRF-1表达升高TNF-α孵育HK-2细胞,Western blot检测IRF-1、C/EBP-β、Klotho、α-SMA和fibronectin的表达变化,结果发现TNF-α以剂量依赖性的方式诱导IRF-1、α-SMA和fibronectin的表达,同时伴随着C/EBP-β和Klotho的表达下调。IRF-1 siRNA转染至HK-2细胞后再加入TNF-α处理,Western blot检测Klotho、α-SMA和fibronectin的表达变化,结果发现,siRNA干扰IRF-1明显逆转了TNF-α对Klotho、α-SMA和fibronectin表达的影响,提示TNF-α通过诱导IRF-1下调Klotho,促进肾小管上皮细胞纤维化标志物表达。同样,C/EBP-β质粒转染HK-2细胞后用TNF-α处理细胞,Western blot检测Klotho、α-SMA和fibronectin的表达变化,发现C/EBP-β过表达也显着逆转了TNF-α诱导的Klotho表达减少,以及α-SMA和fibronectin的表达增加。这些结果提示,TNF-α可以诱导IRF-1表达升高,随之通过抑制C/EBP-β的活化来下调Klotho的表达,并可能因此促进了肾纤维化。第三部分:敲除或抑制IRF-1显着改善肾间质纤维化1.IRF-1基因敲除(IRF-1-/-)小鼠制备的UUO模型肾纤维化明显减轻IRF-1-/-小鼠和野生型（WT）小鼠各16只,10～12周龄,分别随机选取8只制备UUO模型,造模14天后处死各组小鼠,肾脏取材。利用HE、Masson染色评估肾脏损伤和肾纤维化程度,结果发现,IRF-1-/-小鼠梗阻侧肾脏损伤和肾纤维化程度较WT小鼠明显减轻;通过Western blot和免疫染色检测小鼠肾组织中α-SMA和fibronectin的表达变化,发现与WT小鼠相比,IRF-1-/-小鼠梗阻侧肾组织中α-SMA和fibronectin的表达明显减少。这说明敲除IRF-1可以明显减轻UUO模型小鼠肾纤维化。利用Real-time PCR检测炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达变化,发现与WT小鼠相比,IRF-1-/-小鼠梗阻侧肾组织中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达明显减少,提示敲除IRF-1可以明显减轻UUO模型小鼠肾组织的炎症反应。为进一步验证IRF-1的作用机制,Real-time PCR、Western blot和免疫染色检测C/EBP-β和Klotho的表达变化,结果表明,与WT小鼠相比,IRF-1基因敲除可以部分逆转UUO模型小鼠梗阻侧肾组织和肾小管上皮细胞C/EBP-β及Klotho的表达下调。以上结果提示,敲除IRF-1可以明显减轻C/EBP-β和Klotho的表达下调,改善肾间质纤维化;而UUO造成的IRF-1表达升高,及随之而来的C/EBP-β和Klotho表达下调可能是肾间质纤维化发生和发展的重要机制之一。2.UUO模型小鼠尾静脉注射抗TNF-α中和抗体显着抑制Klotho表达下调和肾间质纤维化雄性C57BL/6小鼠32只,10-12周龄,随机选取16只小鼠建立UUO模型,在假手术组和UUO模型组中分别选取8只小鼠尾静脉注射抗TNF-α中和抗体,其余8只小鼠注射等体积的PBS溶液。术后14天处死各组小鼠并肾脏取材。HE、Masson染色评估肾脏损伤和肾纤维化程度,结果发现给予抗TNF-α中和抗体注射的小鼠梗阻侧肾脏损伤和纤维化程度较PBS注射小鼠明显减轻。利用Western blot和免疫荧光双标染色检测肾组织中IRF-1、Klotho、α-SMA和fibronectin的表达,以及IRF-1和Klotho在肾小管上皮细胞的表达情况,结果发现,与注射PBS溶液的小鼠相比,注射抗TNF-α中和抗体显着抑制了UUO模型小鼠梗阻侧肾组织及肾小管上皮细胞中IRF-1的表达升高和Klotho的表达降低。以上结果提示,抗TNF-α中和抗体可通过抑制IRF-1改善肾间质纤维化。结论:CKD患者肾活检标本,UUO模型和ADR模型小鼠肾组织和肾小管上皮细胞中IRF-1表达显着增加,并与肾纤维化程度呈显着正相关;IRF-1过表达显着降低了肾纤维化抑制因子Klotho的表达,并促进肾小管上皮细胞纤维化标志物的表达,其作用与下调Klotho转录的调控因子C/EBP-β的表达有关;进一步研究表明,TNF-α是诱导UUO时肾小管上皮细胞IRF-1高表达的主要原因;而敲除或利用抗TNF-α中和抗体抑制IRF-1则可以显着改善肾间质纤维化。因此,炎症因子诱导的IRF-1表达上调,以及随之导致的肾小管上皮细胞Klotho缺乏可能是肾纤维化发生和发展的重要机制之一,而炎症与IRF-1/Klotho之间的相互影响也会不断促进肾纤维化的持续进展。
林敏[8]（2020）在《Megalin对肾脏局部肾素—血管紧张素系统的影响在高血压恶性肾硬化中的作用》文中研究指明研究背景高血压是慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）的重要原因之一,其肾损害包括良性肾硬化和恶性肾硬化（Malignant hypertensive nephrosclerosis,MHN）。后者多见于血压急骤、显着升高（>180/120 mmHg）的高血压急症,可伴有视网膜、心、脑、微血管等多种靶器官损伤,严重时可危及生命。尽管降压药物不断更新进步,MHN发病率及患病率并未显着改善,因此研究MHN临床病理特点、发病机制以及预后相关因素仍有积极的临床意义。肾素-血管紧张素系统（Renin-angiotensin system,RAS）,特别是肾脏局部RAS在MHN发病中的机制尚不清楚。研究证实表达于肾近端小管刷状缘的内吞蛋白megalin参与了血管紧张素原（Agiotensinogen,Agt）、肾素、血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）等成分的重吸收。西司他丁（Cilastatin）是脱氢肽酶Ⅰ抑制剂,可通过竞争结合的方式缓解多种药物经megalin介导的肾毒性,其不良反应包括低血压,提示其可能通过影响RAS重吸收导致血压降低,但目前尚无相关报道。因此,本研究将基于较大样本恶性肾硬化队列,观察MHN临床病理特点、肾脏RAS活化情况,分析预后及危险因素;同时建立Ang Ⅱ诱导高血压模型模拟MHT患者RAS激活情况,观察西司他丁治疗是否可以干预肾脏RAS或降低血压。研究目的1.观察原发性高血压恶性肾硬化（MHN）的临床病理特点及预后,观察肾素-血管紧张素系统（RAS）活化情况,分析影响预后的因素。2.建立血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导高血压小鼠模型,初步观察应用西司他丁是否影响小鼠肾脏megalin表达及局部RAS水平而降低血压。研究方法1.临床及病理资料收集分析纳入2003年1月1日至2019年5月31日间在北京协和医院就诊的经肾穿刺活检确诊为原发性高血压恶性肾硬化、临床资料完整病例124例,收集其临床、病理及随访资料,终点事件为长期肾脏替代治疗（>3月）或死亡。MHN病理诊断由两位医师独立完成。采集临床资料包括人口学信息、病史、临床表现、辅助检查结果、治疗情况等。利用Aperio数字切片扫描及图像分析系统对肾组织PAS、PASM、Masson染色切片进行半定量分析以评估肾小球硬化指数（Glomerular sclerosis index,GSI）、肾小管萎缩面积比（Tubular atrophy,TA）及间质纤维化面积比（Interstitial fibrosis,IF）。以良性肾硬化及肾小球轻微病变作为对照,采用免疫组化染色及半定量分析方法观察MHN肾组织肾素、ACE2、megalin表达情况,并分析其表达与临床表现及预后相关性。2.Ang II诱导高血压小鼠模型建立皮下植入微渗透泵,以400 ng/（kg·min）速度持续释放Ang II进行建模,持续4周,监测小鼠一般情况及体重、血压变化。第三周起将建模组及假手术组随机拆分成两组,分别予西司他丁 100 mg/kg及生理盐水10 ml/kg皮下注射进行干预。建模4周末取材,收集血、尿进行生化检验,肾脏组织经固定、包埋、切片后进行HE、PAS、Masson等常规染色,以及megalin、DKK3、ACE2免疫组化染色及半定量评估。3.统计方法使用Kolmogorov-Smirnov检验对连续变量进行正态性检验。正态分布计量资料以均值±标准差表示;非正态分布计量资料以中位数（25分位,75分位）表示;计数资料表示为构成比。正态分布连续变量差异性分析采用Student’s t检验,非正态分布连续变量使用Wilcoxon秩检验,样本构成比应用卡方检验及Fisher精确检验。正态分布连续变量行Pearson相关分析,非正态分布、等级变量行Spearman相关分析。生存分析中,使用Kaplan-Meier生存曲线对患者肾脏累计生存率进行单因素分析,使用COX比例风险模型进行多因素回归分析。双侧检验P<0.05定义为具有统计学差异。研究结果一、原发高血压恶性肾硬化临床病理特点及预后分析1.临床病理特点本研究共纳入124例MHN患者,其中男性110例（男女比7.8:1）,平均年龄34.1±8.2岁,女性更年轻（28.9±7.8比34.7±8.1岁,p=0.011）。患者病程中最高血压为226±26/152±24 mmHg,出院时中位估算肾小球滤过率（Estimated glomerular filtrationrate,eGFR）为 25.18 ml/min/1.73m2,93.5%患者已达CKD 3期及以上。患者多有不同程度的代谢异常,如血脂异常（78.9%）、超重或肥胖（76.8%）、高尿酸血症（73.0%）等,同时超过半数患者存在钙磷代谢异常,低钙血症、高磷血症发生率分别为43.5%和28.3%,80%患者存在甲状旁腺激素（Parathyroid hormone,PTH）升高。MHN患者肾脏可观察到肾小球缺血皱缩、硬化表现,中位小球硬化指数为1.49（1.30,1.70）,女性患者肾小球硬化更显着（p<0.001）。PASM及Masson染色可见肾小管细胞萎缩、刷状缘缺失、管腔狭窄、基底膜增厚、纤维组织浸润,中位 TA、IF 均为 65%（50%,80%）。患者血肌酐与 GSI（r=0.227,p=0.002）、TA（r=0.473,p<0.001）以及 IF（r=0.482,p<0.001）均显着相关。患者出院时 eGFR与年龄（r=-0.196,p=0.029）收缩压（r=-0.196,p=0.029）、舒张压（r=-323,p<0.001）、血红蛋白（r=0.576,p<0.001）、血尿酸（r=-0.286,p=0.001）、以及GSI（r=-0.270,p=0.002）、TA（r=-0.574,p<0.001）、IF（r=-0.606,p<0.001）相关。2.RAS评价超过80%患者存在血浆肾素活性（Plasma renin activity,PRA）、Ang Ⅱ、醛固酮升高等全身RAS异常活化表现。免疫组化染色显示MHN患者肾脏megalin表达（平均光密度值0.0019±0.0007）显着低于良性肾硬化（0.0050±0.0022,p<0.001）以及肾小球轻微病变 ACE2（0.0082±0.0033,p<0.001）,ACE2 表达也显着低于良性肾硬化（0.0029±0.0014 比 0.0043±0.0016,p=0.039）。3.预后分析本队列患者第1、3、5和10年的累积肾脏生存率分别为91%、76%、64%和33%。多因素COX回归分析显示出院eGFR（OR0.92[0.86,0.98],p=0.009）及尿蛋白水平（OR 2.04[1.33,3.11],p<0.001）,血压≥140/90 mmHg（OR 6.92[1.59,30.23],p=0.010）是影响预后的独立危险因素。二、高血压恶性肾硬化肾素-血管紧张素系统活化机制初探.1.Ang Ⅱ诱导高血压小鼠动物模型的建立皮下埋植Ang Ⅱ微渗透泵后一周,建模组小鼠血压即显着高于假手术组,并维持高血压直至第4周末实验结束（123.6±22.3比102.5±8.6mmHg,p=0.006）。第二周起建模组小鼠体重增加显着快于假手术组,第四周末体重差异显着（26.76±1.23比25.11±1.63 g,p=0.011）。建模组小鼠四周末时尿Ang Ⅱ肌酐比较基线显着升高（230.8±42.5比179.1±43.7 pg/mg,p=0.010）,且显着高于同时期假手术组（187.3±41.8 pg/mg,p=0.014）。2.西司他丁对Ang Ⅱ诱导高血压小鼠的影响在Ang Ⅱ诱导高血压小鼠及假手术组小鼠中应用西司他丁并不影响小鼠血压及体重。尿蛋白、尿肌酐、尿电解质分析未见各组显着差异。Ang Ⅱ建模小鼠肾脏病理HE染色结果显示Ang Ⅱ可促进小鼠球旁器增生（p=0.001）,而应用西司他丁可进一步加重球旁器增生（p=0.003）。Megalin免疫组化染色提示Ang Ⅱ可减少小鼠肾脏megalin表达（p=0.003）,而西司他丁可进一步减少megalin表达（p=0.027）。RAS评价提示西司他丁可增加Ang Ⅱ诱导高血压小鼠肾脏肾素排泄（尿肾素活性2.21±1.46 比 0.74±1.00 ng/ml·h,p=0.032）。结论本研究条件下:1.高血压恶性肾硬化多见于青年男性,肾功能损伤严重,伴RAS异常活化,女性患者发病年龄更低且病理损伤更重;2.高血压恶性肾硬化患者第1、3、5和10年的累积肾脏生存率分别为91%、76%、64%和33%,出院eGFR、24小时尿蛋白量、血压≥140/90 mmHg是预测ESRD的独立危险因素;3.血管紧张素Ⅱ诱导高血压小鼠肾脏球旁器增生、megalin及ACE2表达减少,megalin抑制剂西司他丁可进一步加重上述病变,并增加建模小鼠肾脏肾素排泄,但不影响血压。
谭令[9]（2020）在《三草降压汤对SHR肾脏TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路调控的研究》文中指出背景:目前,全世界近三分之一成年人患有的高血压[1],我国高血压患者已达3亿之多[2]。因此,高血压已成为消耗社会医疗资源的主要影响因素之一,给国家和家庭带来了的经济负担日趋严重。高血压所引起的心、脑、肾等靶器官损害是高血压患者尤其不能忽视的风险,其中高血压导致的肾脏损害发生率已高达18%[3],仅次于糖尿病肾病和肾小球肾炎。在高血压的中医治疗方面,伤寒大家刘渡舟教授创立的三草降压汤（Sancao Decoction,SCD）临床疗效显着,SCD由芍药甘草汤加龙胆草、益母草、夏枯草组成,具有清肝泻火、养阴柔肝、活血通经和利水散结等功效。本课题组前期研究已发现SCD可通过抗炎作用显着降低血压,因此,本研究拟在此基础上探究其能否通过抗炎作用进一步改善高血压造成的肾脏损害。目的:1.观察SCD对自发性高血压大鼠的血压、肾功能、尿液生化指标及肾脏组织形态学变化的改善作用。2.通过检测肾脏组织中Toll样受体4（TLR4）、核转录因子-κ B（NF-κ B）、Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）等蛋白的表达,探索SCD对TLR4/NF-κ B/NLRP3信号通路表达的影响,从而明确SCD改善高血压肾损害及其可能机制。方法:选取24只20周龄的雄性自发性高血压大鼠（Spontaneously Hypertensive Rat,SHR）,随机分为模型组（SHR组）、卡托普利组（CPT组）（30mg/kg）、三草降压汤组（SCD组）（10.6g/kg）,8只同周龄的雄性WKY大鼠作为正常对照组（WKY组）。各组连续灌胃给药12周,分别于给药第4周、第8周和第12周检测各组大鼠血压,并于给药12周后,留取各组大鼠24小时尿液,生化法检测尿微量白蛋白（mAlb）、尿肌酐（UCRE）和尿蛋白（UP）等指标,实验结束后腹主动脉取血,取血清用生化法检测各组大鼠血肌酐（SCR）、尿素氮（BUN）和血尿酸（UA）等肾功能指标。采用苏木素-伊红（HE）染色观察肾组织病理变化,Masson染色评估肾组织纤维化程度。采用免疫组织化学法（IHC）检测Toll样受体4（TLR4）、髓样分化因子88（MyD88）核转录因子-κB（NF-κ B）、Nod样受体蛋白3（NLRP3）和白细胞介素-1 β（IL-1 β）蛋白的表达。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测单核细胞趋化因子-1（MCP-1）和IL-1 β蛋白的表达量。采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测TLR4、NF-κ B和NLRP3的蛋白表达情况。最后应用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。结果:1.各组大鼠血压及心率的变化给药前,SHR 组、CPT 组及 SCD 组收缩压（Systolic Blood Pressure,SBP）、舒张压（Diastolic Blood Pressure,DBP）和平均动脉压（Mean Arterial Pressure,MAP）均无统计学差异（P>0.05）,且上述三类血压值均显着高于WKY组（P<0.01）;给药4周后、8周后及12周后,与WKY组相比,SHR组的收缩压、舒张压和平均动脉压均显着升高（P<0.01）,与SHR组相比,CPT组和SCD组的收缩压、舒张压和平均动脉压均明显降低（P<0.01）。在整个治疗过程中,与WKY组相比,SHR组、CPT组及SCD组的心率明显偏高,差异有统计学意义（P<0.01）,而SHR组、CPT组和SCD组三组之间的心率无统计学差异（P>0.05）。2.各组大鼠尿液生化指标的变化治疗后,与WKY组相比,SHR组大鼠的尿微量白蛋白、尿蛋白显着升高（P<0.01）,尿肌酐显着降低（P<0.01）,尿量明显减少（P<0.01）,24小时尿白蛋白定量和尿蛋白定量显着升高（P<0.01）;与SHR组大鼠相比,SCD组和CPT组大鼠的尿微量白蛋白和尿蛋白均显着降低（P<0.01）,且两组的尿肌酐浓度均明显增高（P<0.01）,SCD组的尿量显着增多（P<0.01）,而CPT组的尿量未见明显增多（P>0.05）,SCD组和CPT组的24小时尿白蛋白定量均显着降低（P<0.01）,但此两组的24小时尿蛋白定量无明显改变（P>0.05）。3.各组大鼠肾重、体质量和肾脏指数的变化治疗后,与WKY组相比,SHR组大鼠双侧肾脏总重量无明显改变（P>0.05）,但SHR组大鼠的体质量明显降低（P<0.01）,SHR组的肾脏指数显着升高（P<0.01）;与SHR组相比,SCD组和CPT组大鼠的体质量无明显改变（P>0.05）,CPT组大鼠的肾脏指数明显降低（P<0.01）,但SCD组大鼠的肾脏指数无明显降低（P>0.05）。4.各组大鼠肾功能的变化治疗后,与WKY组相比,SHR的尿素氮（BUN）、血肌酐（SCR）和血尿酸（UA）均显着升高（P<0.01）,与SHR组相比,SCD组和CPT组尿素氮、血肌酐和血尿酸均显着降低,差异有统计学意义（P<0.01）。5.各组大鼠肾脏组织病理形态学的变化HE染色结果显示,与WKY组相比,SHR组大鼠部分肾小球重度萎缩,肾内动脉周围重度炎性浸润,肾小球系膜基质增生明显,肾小管扩张。与模型组相比,SCD组和CPT组大鼠肾小球萎缩程度减轻,肾小管无扩张。（2）Masson染色结果显示:与WKY组相比,SHR组大鼠肾组织内胶原纤维沉积明显增多,SCD组和CPT组胶原纤维的表达明显减少。6.SCD对TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路及其相关炎症因子表达的影响IHC及Western blot检测结果发现,与WKY组相比,SHR组的TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3和IL-1 β蛋白的表达量均显着升高（P<0.01）;与SHR组相比,CPT组和SCD组的TLR4、MyD88、NF-κ B、NLRP3和IL-1 β蛋白的表达量均显着降低（P<0.01）。ELISA检测结果表明,与WKY组相比,SHR组的MCP-1和IL-1 β的表达量显着升高（P<0.01）;与SHR组相比,CPT组和SCD组的MCP-1和IL-1 β表达量明显降低（P<0.01）。结论:1.三草降压汤能有效改善高血压肾损害,其作用主要通过降低血压,改善尿液生化异常,降低血肌酐、尿素氮和血尿酸水平,改善肾脏组织的病理形态等方面实现;2.三草降压汤可通过调控TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路,抑制肾脏炎症反应,从而改善高血压肾损害。
王丽娟[10]（2020）在《基于网络药理学方法探讨虎杖防治DKD肾保护作用的机制研究》文中研究指明背景DKD是糖尿病最主要的微血管并发症之一,也是导致ESRD的首要原因。其发病机制复杂,涉及遗传因素、环境因素,与炎症、氧化应激、RAAS系统的激活、纤维化均相关。目前以RAAS阻滞剂为基础的综合治疗可以改善DKD患者的病情,却并不能完全阻止DKD进展至ESRD。因此,开发安全有效的新药物以预防或延迟DKD的启动和进展至关重要。DKD症状属于祖国医学“消渴”“水肿”“关格”“虚劳”等范畴,目前比较公认的DKD中医病名当属“消渴肾病”,其病因与先天禀赋不足、后天饮食不节、脏腑亏损、劳欲伤肾相关。病机为脾肾亏虚,气阴两虚,久则夹痰湿、浊毒、瘀血,而致病势加重、病程缠绵。可归纳为:虚、瘀、浊,虚是基本条件,瘀为核心病机,浊乃最终结局。中药虎杖是治疗糖尿病的传统中草药,如唐朝甄权所着《药性论》所云:虎杖能治大热烦躁,止渴,利小便,压一切热毒。虎杖,性味微苦微寒,有清热解毒、利胆退黄、止咳化痰、散瘀止痛的功效,契合DKD“瘀”之核心病机。同时中医理论认为,清热解毒类中药往往具有比较明显的抗炎作用。许多研究均已证实DKD与高血糖和肾缺氧引起的氧化应激和炎症相关,并且在DKD的进展中,炎症途径最为核心,是导致肾小球硬化进展的重要因素,促炎细胞因子和趋化因子（IL-1β和MCP-1）、C反应蛋白（CRP）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平与DKD的发生和进展相关。虎杖苷是虎杖的主要有效成分,是白藜芦醇的糖苷形式,两者药理作用相类似,但虎杖苷具有更强的稳定性和抗氧化作用。同时,虎杖苷还是根皮苷的结构类似物,被推测可能同样具有SGLT抑制作用。因此,虎杖苷可能具有新颖的作用机制,可能有一定的肾脏保护作用,降糖保肾双获益,有望成为防治DKD的潜在药物。目的1.采用网络药理学方法和思路,探讨虎杖多组分协同治疗DKD的信号通路及作用机制。2.从细胞实验和动物实验两方面,研究虎杖苷对于SGLT1/2、GLUT1/4活性的抑制作用,以及对STZ诱导的糖尿病大鼠血糖调节和肾脏损伤的影响。方法1.网络药理学利用中药系统药理学数据库（TCMSP）检索并筛选虎杖活性及优效化学成分及潜在作用靶点,通过多个疾病数据库检索糖尿病肾脏病相关靶点,并通过Cytoscape软件分别构建“虎杖活性成分-糖尿病肾脏病”靶点网络图,采用ClueGO分析工具,GO、KEGG基因富集分析虎杖治疗糖尿病肾脏病的作用靶点的生物进程、作用通路等。2.细胞实验,观察虎杖苷对HEK293细胞和3T3-L1脂肪细胞的干预作用及相关指标的检测采用稳定表达SGLT1或SGLT2的人类胚胎肾HEK293细胞作为载体,以14C-AMG为底物来评价体外抑制SGLTs的活性,使用顶部计数微孔板闪烁计数器计算每个孔的放射活性和相应的IC50值,评价不同浓度的虎杖苷的干预作用。采用3T3-L1脂肪细胞,有或没有胰岛素的情况下,不同浓度虎杖苷对于2-脱氧-D-葡萄糖摄入量的影响,使用液体闪烁计数器测量放射性信号,计算2-DG抑制百分比,评价不同浓度虎杖苷GLUT1/4的抑制活性。3.2型糖尿病肾脏病大鼠模型的建立,虎杖苷对DKD模型大鼠的干预及相关指标检测高糖高脂饲养大鼠8周以诱导胰岛素抵抗,然后单次腹膜内注射STZ（35mg/kg bwt）建立DKD大鼠模型,连续2次空腹血糖（FBG）>16.7mmol/L,24小时尿蛋白>20mg为建模成功标准。将大鼠随机分组至代谢笼,分为4组:正常对照组（Normal Control）,DKD模型组（STZ）,阳性对照组（根皮苷）和治疗组（虎杖苷）。各组大鼠分别灌服不同剂量的虎杖苷（20-120mg/kg bwt）、根皮苷（120mg/kg bwt）及对照溶剂（0.25%羧甲基纤维素钠溶液）,连续6周。定期检测大鼠饲料和水的摄入量,检测各组大鼠干预前后血糖、HbA1c、尿素氮、肌酐、24h尿糖、24h尿蛋白,ELISA法测定血清IL-1β,TNF-α,MCP-1和CRP的水平,并探讨时效与量效关系。取1/2左侧肾组织,组织切片予H&E染色,光学显微镜下观察其病理结构的形态学改变。结果1.网络药理学通过OB、DL筛选及文献检索补充,获得虎杖15种优效活性成分,并预测了290个潜在作用靶点。通过韦恩分析得到37个治疗糖尿病肾脏病的作用靶点,并进一步筛选出17个关键靶点。利用ClueGO富集分析治疗靶点被富集在糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、粘附连接、HIF-1信号通路、胰岛素抵抗、VEGF信号通路等47条显着通路和活性氧代谢过程、小分子代谢过程的正调控、血管系统发育的正调控、活性氧生物合成过程等87个显着生物过程。2.体外细胞实验虎杖苷体外抑制SGLT1、SGLT2活性评估,选取根皮苷作为阳性对照药。研究结果表明,虎杖苷对SGLT1、SGLT2均有明显抑制作用,IC50分别为1968nM和878.5nM,与根皮苷组相比,虎杖苷具有中等程度的SGLT2抑制活性,表明虎杖苷可能是潜在的SGLT1/2双重抑制剂。虎杖苷对GLUT1、GLUT4的表达作用评估,以细胞松弛素B作为对照组。研究结果显示,在存在胰岛素的情况下,1μM虎杖苷仅轻微抑制2-DG的摄取,而10μM、100μM虎杖苷对2-DG摄取分别产生32%、78%的抑制,说明虎杖苷呈剂量依赖性抑制GLUT4的活性;另一方面,在存在胰岛素的情况下,细胞松弛素B对GLUT4的活性抑制显着增加了 96%。但是,如果没有胰岛素,虎杖苷对GLUT1的抑制同样呈剂量依赖性,但是10μM虎杖苷对对2-DG摄取仅产生27%的抑制作用,10μM细胞松弛素B对GLUT1的活性抑制增加到90%。说明虎杖苷可能作为潜在的SGLT1/SGLT2双重抑制剂,对GLUT1和GLUT4具有高选择性。3.在体动物实验本研究时效与量效关系研究显示,虎杖苷显着且剂量依赖性降低糖尿病大鼠的血糖、促进尿液葡萄糖的排泄,虎杖苷在120mg/kg bwt的剂量产生最佳的降血糖作用。长期药理作用研究表明,虎杖苷在整个治疗过程中均显示持续的降血糖作用,可显着降低DKD模型组大鼠的HbA1c。虎杖苷治疗可减轻DKD大鼠尿蛋白、血清肌酐和尿素氮等肾功能指标,改善多尿,多饮和多食等症状。DKD模型组大鼠血清炎症因子IL-1β,TNF-α,MCP-1和CRP水平显着升高,虎杖苷治疗后,可明显降低DKD大鼠上述炎症因子水平。同时,本实验肾脏组织病理学检查结果表明,相对于正常对照组,DKD模型组大鼠的肾小管和肾小球结构明显恶化,伴有大量炎性细胞浸润。但虎杖苷治疗后,肾组织细胞排列规则,肾小球和肾小管结构相对完整,炎性细胞明显减少。结论1.虎杖主要活性成分可调控糖尿病肾脏病发病重要通路中的多个靶点。2.虎杖苷体外对SGLT1/2、GLUT1/4均有明显抑制作用,具有中等程度的SGLT2抑制活性,虎杖苷可能是潜在的SGLT1/2双重抑制剂。3.虎杖苷体内显着且剂量依赖性降低糖尿病大鼠的血糖、促进尿糖排泄,降低HbA1c、尿蛋白、血清肌酐、尿素氮及炎症因子IL-1β,TNF-α,MCP-1和CRP的水平。表明虎杖苷可能是新型的SGLT1/SGLT2双靶点抑制剂,具有一定的肾脏保护作用,其肾保护机制可能通过降糖、抗炎、抗氧化等多种途径。
二、肾素-血管紧张素系统对肾纤维化的作用研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肾素-血管紧张素系统对肾纤维化的作用研究进展（论文提纲范文）
（1）基于NLRP3炎症小体信号通路探讨“浊毒致瘀”病机下的高血压肾病机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 中医中高血压肾病的理论 |
| 1. 高血压肾病的中医理论 |
| 2. 中医临床治疗高血压肾病 |
| 第二节 高血压肾病的现代研究进展 |
| 1. 肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活 |
| 2. 肾脏中的钠潴留水平增加 |
| 3. 内皮功能障碍 |
| 4. 交感神经系统过度活跃 |
| 第三节 高血压肾纤维化与NLRP3炎症小体的研究进展 |
| 1. NLRP3炎症小体的激活机制 |
| 2. NLRP3炎症小体介导的肾纤维化机制 |
| 第四节 小结 |
| 1. 立项依据 |
| 2. 研究假设 |
| 3. 研究意义 |
| 4. 研究内容 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 建立浊毒致瘀病机下的高血压肾纤维化模型 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验仪器 |
| 3. 实验方法 |
| 4. 实验结果 |
| 5. 讨论 |
| 第二节 NLRP3是肾纤维化的发生发展的关键靶点 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三节 补气益肾中药黄芪治疗高血压肾病药效物质初探 |
| 1. 实验方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间参与课题及发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件1 统计学处理合格证明 |
（2）利水渗湿中药通过调控RAS改善慢性肾损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肾脏纤维化及其分子生物学机制 |
| 1.1.1 肾脏纤维化 |
| 1.1.2 TGF-β1/Smad通路与肾脏纤维化 |
| 1.1.3 Wnt/β-catenin通路与肾脏纤维化 |
| 1.1.4 RAS与肾脏纤维化 |
| 1.2 利水渗湿药 |
| 1.2.1 茯苓 |
| 1.2.2 泽泻 |
| 1.2.3 猪苓 |
| 第二章 RAS/TGF-β/Smad轴在肾小管间质纤维化和足细胞损伤中的作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 药材及细胞 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验耗材及试剂 |
| 2.2.4 统计分析及绘图软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 茯苓酸ZA的提取与分离 |
| 2.3.2 细胞培养及药物处理 |
| 2.3.3 PZA对HK-2 细胞活力的影响 |
| 2.3.4 Small interfering RNA(siRNA)细胞转染 |
| 2.3.5 实时定量聚合酶链反应 |
| 2.3.6 蛋白印迹分析(Western blots) |
| 2.3.7 免疫荧光染色分析(Immunofluorescence staining) |
| 2.3.8 免疫共沉淀分析 |
| 2.3.9 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 PZA结构鉴定 |
| 2.4.2 PZA对HK-2 细胞活力的影响 |
| 2.4.3 PZA对HK-2 细胞表型及促纤维化标志物的影响 |
| 2.4.4 PZA对 HK-2 细胞中TGF-β/Smad信号通路的影响 |
| 2.4.5 PZA对 HK-2 细胞中TGF-β1或AngⅡ激活RAS的影响 |
| 2.4.6 PZA对 HK-2 细胞中Smad2/3 磷酸化的影响 |
| 2.4.7 PZA对 p-Smad2/3与TGFβRⅡ相互作用的影响 |
| 2.4.8 PZA对 MPC5 细胞中RAS及 TGF-β/Smad通路的影响 |
| 2.5 讨论与小结 |
| 第三章 RAS/Wnt/β-catenin轴在足细胞损伤和肾小管间质纤维化中的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 药材 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验耗材及试剂 |
| 3.2.4 统计分析及绘图软件 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 药物的提取与分离 |
| 3.3.2 细胞培养及药物处理 |
| 3.3.3 实时定量聚合酶链反应 |
| 3.3.4 蛋白印迹分析(Western blots) |
| 3.3.5 免疫荧光染色分析(Immunofluorescence staining) |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 化合物结构鉴定 |
| 3.4.2 AngⅡ激活HK-2 细胞中Wnt/β-catenin信号通路 |
| 3.4.3 HK-2 细胞中RAS和 Wnt/β-catenin信号通路相互作用 |
| 3.4.4 AngⅡ通过Wnt/β-catenin信号通路诱导ECM积累 |
| 3.4.5 AngⅡ引起HK-2 细胞中的氧化应激和炎症反应 |
| 3.4.6 AngⅡ激活MPC5 细胞中Wnt/β-catenin信号通路 |
| 3.4.7 MPC5 细胞中RAS和 Wnt/β-catenin信号通路相互作用 |
| 3.4.8 AngⅡ通过Wnt/β-catenin信号通路诱导足细胞损伤 |
| 3.4.9 AngⅡ引起MPC5 细胞中氧化应激和炎症反应 |
| 3.5 讨论与小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）原儿茶醛抑制lncRNA9884介导的炎症以改善肾脏纤维化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分:原儿茶醛对小鼠慢性梗阻性肾脏疾病的作用 |
| 材料与方法 |
| 1.实验动物 |
| 2.实验试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学处理应用 |
| 结果 |
| 1.原儿茶醛对梗阻性肾病小鼠肾脏外观及功能的影响 |
| 2.原儿茶醛改善梗阻性肾病小鼠肾脏结构变化 |
| 3.原儿茶醛对梗阻性肾病小鼠肾脏上皮-间质转化所导致纤维化的作用 |
| 4.原儿茶醛对梗阻性肾病激活巨噬细胞引起的炎症反应的影响 |
| 5.原儿茶醛改善梗阻性肾病小鼠炎症因子的蛋白表达 |
| 6.原儿茶醛改善梗阻性肾病小鼠促炎细胞因子的m RNA表达 |
| 7.原儿茶醛可参与调节NF-κB和 Smad3 信号途径 |
| 8.原儿茶醛可抑制梗阻性肾病小鼠中LRNA9884 的表达 |
| 第二部分:原儿茶醛分别在IL-1β诱导的炎症和TGF-β1 诱导的纤维化微环境中对小鼠原代肾小管上皮细胞的作用 |
| 材料与方法 |
| 1.细胞培养 |
| 2.实验试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学处理应用 |
| 结果 |
| 1.原代肾小管上皮细胞的鉴定 |
| 2.原儿茶醛对肾小管上皮细胞的干预浓度筛选 |
| 3.原儿茶醛改善了IL-1β诱导的肾小管上皮细胞促炎因子的蛋白表达 |
| 4.原儿茶醛改善了IL-1β诱导的肾小管上皮细胞促炎因子和LRNA9884的mRNA表达 |
| 5.原儿茶醛对IL-1β诱导的肾小管上皮细胞形态的影响 |
| 6.过表达LRNA9884 阻碍了PCA在 IL-1β诱导的肾小管上皮细胞中的抗炎作用 |
| 7.原儿茶醛抑制了TGF-β1 诱导的肾小管上皮细胞间质转化 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| 综述 肾纤维化的发病机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）原发性高血压患者肾功能影响因素及中医证候相关性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 高血压肾损害的西医研究进展 |
| 1 流行病学 |
| 2 高血压肾损害的危险因素 |
| 3 高血压肾损害的治疗 |
| 参考文献 |
| 综述二 高血压肾损害的中医研究进展 |
| 1 中医对高血压的认识 |
| 2 中医对慢性肾脏病的认识 |
| 3 中医对高血压肾损害的认识 |
| 4 中医药治疗高血压肾病的机制 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 中医辨证分型标准 |
| 1.4 纳排标准 |
| 1.5 研究方法 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 研究结果 |
| 2.1 原发性高血压患者肾功能分期情况 |
| 2.3 中医证候分布情况 |
| 2.4 原发性高血压患者肾功能影响因素探讨 |
| 3 讨论 |
| 3.1. 患者基本资料 |
| 3.2 中医证候分布 |
| 3.3 原发性高血压患者肾功能的相关因素 |
| 3.4 原发性高血压患者肾功能进展影响因素 |
| 4 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）短期高盐饮食对不同年龄、性别C57BL/6J小鼠肾脏纤维化的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中英缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）特发性膜性肾病肾小管间质病变与血瘀证的相关性研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| abstract |
| 引言 |
| 临床研究 |
| 1.研究对象 |
| 2.入选标准 |
| 2.1 西医诊断标准 |
| 2.2 中医诊断标准 |
| 2.3 纳入标准 |
| 2.4 排除标准 |
| 3.研究方法 |
| 3.1 观察指标 |
| 3.1.1 一般资料 |
| 3.1.2 病理资料 |
| 3.1.3 临床指标 |
| 3.2 质量控制 |
| 3.3 统计学方法 |
| 4.研究结果 |
| 4.1 一般资料 |
| 4.1.1 性别 |
| 4.1.2 年龄、病程 |
| 4.1.3 病理 |
| 4.1.4 合并疾病 |
| 4.1.5 中医证侯 |
| 4.2 T1组(轻度)和T2组(中度)患者临床资料比较分析 |
| 4.2.1 T1组和T2组患者一般资料比较 |
| 4.2.2 T1组和T2组患者合并疾病分析 |
| 4.2.3 T1组和T2组患者病理资料比较 |
| 4.2.4 T1组和T2组患者实验室检查指标比较 |
| 4.2.5 T1组和T2组患者本虚证比较 |
| 4.3 155 例血瘀证患者的血瘀证侯分析 |
| 4.3.1 155例血瘀证患者血瘀证积分分布情况 |
| 4.3.2 不同性别血瘀证积分比较 |
| 4.3.3 不同年龄段血瘀证积分比较 |
| 4.3.4 不同病程血瘀证积分比较 |
| 4.3.5 不同病理分期患者血瘀证积分比较 |
| 4.3.6 不同程度的肾小管间质病变患者血瘀证积分比较 |
| 4.3.7 不同本虚症患者血瘀证分布比较 |
| 4.4 155例血瘀证患者血瘀程度和肾小管间质病变的相关性分析 |
| 4.5 IMN患者肾小管间质病变影响因素分析 |
| 讨论 |
| 1.中医学对特发性膜性肾病的认识 |
| 2.研究结果分析 |
| 结语 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 肾小管间质病变的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 发表论文 |
（7）IRF-1通过抑制Klotho促进肾间质纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 IRF-1与肾间质纤维化的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 IRF-1 通过调控Klotho促进肾小管上皮细胞高表达纤维化标志物的作用和机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 敲除或抑制IRF-1显着改善肾间质纤维化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述Klotho在肾间质纤维化中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（8）Megalin对肾脏局部肾素—血管紧张素系统的影响在高血压恶性肾硬化中的作用（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 原发高血压恶性肾硬化临床病理特点及预后分析 |
| 第一节 原发高血压恶性肾硬化临床病理特点 |
| 第二节 原发高血压恶性肾硬化肾素-血管紧张素系统活化情况 |
| 第三节 原发高血压恶性肾硬化预后及危险因素分析 |
| 第二部分 高血压恶性肾硬化肾素血管紧张素系统活化机制初探 |
| 第一节 血管紧张素Ⅱ诱导高血压小鼠动物模型的建立 |
| 第二节 西司他丁对血管紧张素Ⅱ诱导高血压小鼠的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述: 慢性肾脏病生物标志物作用和类型 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）三草降压汤对SHR肾脏TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中医药治疗高血压肾损害的研究进展 |
| 1 概述 |
| 2 单味中药治疗高血压肾损害研究 |
| 3 中药药对治疗高血压肾损害的研究 |
| 4 复方治疗高血压肾损害研究 |
| 5 中成药治疗高血压肾损害研究 |
| 6 中药提取物治疗高血压肾损害研究 |
| 7 中西医结合治疗高血压肾损害研究 |
| 8 中医辨证治疗 |
| 9 其它中医疗法 |
| 10 结语 |
| 综述二 高血压肾损害的病理机制研究进展 |
| 1 遗传因素 |
| 2 环境因素 |
| 3 代谢因素 |
| 4 血流动力学异常 |
| 5 激素和旁分泌因子 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究部分 |
| 实验一 三草降压汤对SHR血压及肾损害的影响研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 实验二 三草降压汤对SHR肾脏TLR4/NF-κB/NLRP3通路的调控研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 动物模型的选择依据 |
| 2 阳性对照药的选择依据 |
| 3 TLR4/NF-κ B/NLRP3信号通路及其相关炎症指标的选择 |
| 4 肾损伤标志物的选择依据 |
| 5 实验结果的分析讨论 |
| 6 三草降压汤的配伍规律分析 |
| 参考文献 |
| 第四部分 结语 |
| 1 小结 |
| 2 结论 |
| 3 创新点 |
| 4 不足与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）基于网络药理学方法探讨虎杖防治DKD肾保护作用的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 主要缩略词 |
| 第一部分 前言 |
| 第二部分 文献研究 |
| 一、中医对糖尿病肾脏病的认识 |
| 1. 对DKD中医病名的认识 |
| 2. 对DKD病因病机的认识 |
| 3. 中医药治疗DKD的现状和进展 |
| 二、中药虎杖及其提取物虎杖苷发挥肾保护作用机制研究进展 |
| 1. DKD的定义及流行病学研究 |
| 2. DKD治疗中的困境和争议 |
| 3. DKD治疗中现有药物的综合探索及未来方向 |
| 4. 虎杖及其提取物虎杖苷概述 |
| 5. 虎杖及其提取物虎杖苷发挥肾脏保护效应的机制研究 |
| 第三部分 基于网络药理学的虎杖防治DKD活性成分靶点探究 |
| 一、概述 |
| 二、资料与方法 |
| 1. 虎杖所含主要化学成分的收集和筛选 |
| 2. 化学成分潜在靶点收集 |
| 3. 糖尿病肾脏病疾病靶点预测 |
| 4. 虎杖化学成分作用靶点与糖尿病肾脏病靶点集韦恩分析 |
| 5. 生物分子网络建立及富集分析 |
| 三、结果 |
| 1. 虎杖中候选化学活性成分的收集和筛选 |
| 2. 化学成分潜在靶点收集 |
| 3. 糖尿病肾脏病相关靶点的搜集 |
| 4. 虎杖活性成分作用靶点与糖尿病肾脏病疾病靶点交集 |
| 5. 生物分子网络建立及富集分析 |
| 四、讨论 |
| 五、结语 |
| 第四部分 虎杖苷对于SGLT1/2、GLUT1/4活性的影响 |
| 一、仪器设备及耗材 |
| 二、实验方法 |
| 1. 细胞培养 |
| 2. 细胞分组 |
| 3. SGLT1和SGLT2体外抑制活性评估 |
| 4. 3T3-L1脂肪细胞2-脱氧-D-葡萄糖摄入量的评估 |
| 5. 统计学处理 |
| 三、实验结果 |
| 1. 虎杖苷对SGLT1和SGLT2的抑制活性 |
| 2. 虎杖苷对GLUT1和GLUT4的表达影响 |
| 四、小结 |
| 五、讨论 |
| 第五部分 虎杖苷对糖尿病大鼠血糖调节和肾脏损伤的影响 |
| 一、实验材料 |
| 1. 仪器设备及耗材 |
| 2. 药物及试剂 |
| 3. 抗体及试剂盒 |
| 二、实验方法 |
| 1. 糖尿病肾脏病动物模型的建立 |
| 2. 实验动物分组 |
| 3. 虎杖苷、根皮苷给药量 |
| 4. 大鼠一般情况观察及指标检测 |
| 5. 肾组织学观察 |
| 6. 统计学处理 |
| 三、实验结果 |
| 1. 一般情况观察 |
| 2. 虎杖苷对糖尿病大鼠血糖水平及24h尿糖的影响 |
| 3. 虎杖苷对血糖、HbA1c、24h尿糖、饲料及饮水摄入量的影响 |
| 4. 虎杖苷对炎症反应的影响 |
| 5. 虎杖苷对STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏组织及肾功能的影响 |
| 四、小结 |
| 五、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 博士期间发表论文 |
| 承担课题 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
四、肾素-血管紧张素系统对肾纤维化的作用研究进展（论文参考文献）
- [1]基于NLRP3炎症小体信号通路探讨“浊毒致瘀”病机下的高血压肾病机制[D]. 张凯敏. 广州中医药大学, 2021
- [2]利水渗湿中药通过调控RAS改善慢性肾损伤的机制研究[D]. 刘静茹. 西北大学, 2021(12)
- [3]原儿茶醛抑制lncRNA9884介导的炎症以改善肾脏纤维化的研究[D]. 杨洁珂. 西南医科大学, 2021(01)
- [4]原发性高血压患者肾功能影响因素及中医证候相关性分析[D]. 魏照晴. 北京中医药大学, 2021(08)
- [5]短期高盐饮食对不同年龄、性别C57BL/6J小鼠肾脏纤维化的影响及机制研究[D]. 黄娟. 遵义医科大学, 2020
- [6]特发性膜性肾病肾小管间质病变与血瘀证的相关性研究[D]. 沙其朋. 山东中医药大学, 2020(12)
- [7]IRF-1通过抑制Klotho促进肾间质纤维化的机制研究[D]. 李燕. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [8]Megalin对肾脏局部肾素—血管紧张素系统的影响在高血压恶性肾硬化中的作用[D]. 林敏. 北京协和医学院, 2020(05)
- [9]三草降压汤对SHR肾脏TLR4/NF-κB/NLRP3信号通路调控的研究[D]. 谭令. 北京中医药大学, 2020(04)
- [10]基于网络药理学方法探讨虎杖防治DKD肾保护作用的机制研究[D]. 王丽娟. 南京中医药大学, 2020(01)