一、不同方法抽提血清HBV DNA得率的比较（论文文献综述）
黄晨璐,许伟,胡乾坤,张小楠,李强,黄玉仙,陈良[1]（2020）在《实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价》文中研究指明为评价实时荧光核酸恒温扩增试验（simultaneous amplification testing,SAT）与定量反转录-聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测血清样本中乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者HBV DNA≥100IU/mL 81例、HBV DNA<100IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%（77/81）。2种方法具有较好的相关性与一致性（R2=0.803和CCC=0.882）。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异（t=1.617,P=0.110）。在HBV DNA<100IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%（75/76）,qRT-PCR为88.16%（67/76）,2种方法相关性与一致性较差（R2=0.326和CCC=0.438）。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异（t=3.654,P<0.001）。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。
徐博文[2]（2020）在《用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA》文中认为现有的抗病毒药物比如核苷类似物（nucleotide analogues,NAs）、聚乙二醇化的干扰素α（PEGylated interferon alpha,PEG-IFNα）等可以有效抑制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的复制,但是难以清除肝细胞内的HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）。残余的cccDNA容易导致停药后慢性乙型病毒性肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）的复发甚至进展。因此肝内cccDNA的水平是判断乙肝是否被治愈的重要参考指标。然而直接肝脏穿刺活检检测肝内cccDNA的水平属于有创检查,无法作为常规临床检查手段,需要寻找无创的替代手段,比如血清学检查反映肝内cccDNA的水平等。乙型肝炎病毒cccDNA可以生成0.7kb、2.1kb、2.4kb、3.5kb等多种不同长度的转录本,其中3.5kb的前基因组RNA（pregenomic RNA,pgRNA）是唯一能够反转录生成松弛环状DNA（relaxed circular DNA,rc DNA）负链的转录本。rc DNA是完整HBV颗粒的必要组成,因此pgRNA是HBV复制周期中的关键分子。血清中的pgRNA水平被证明和肝脏内cccDNA的转录活性具有较好的相关性,尤其在经过NAs治疗的病人,血清pgRNA比血清HBV DNA更能反映肝内cccDNA的转录活性,并且能够帮助判断停用抗病毒药物后乙肝在病毒学水平复发的几率,对于指导停药时机具有重要意义。因此血清pgRNA有望成为新的临床检验指标。尽管血清HBV RNA有独特的临床意义,但是其仍然无法替代HBV DNA成为更好的临床检测指标:HBV DNA水平不仅是决定患者是否进行抗病毒治疗的重要依据,同时也是评价患者病毒学应答的重要指标。另外有研究显示,HBV RNA与DNA的比值在不同自然感染史的CHB患者之间存在显着差异,因此HBV DNA和RNA的综合水平对于判断HBV感染阶段、疾病预后具有重要意义。但是目前临床上只有标准化的HBV DNA检测试剂盒,而无HBV RNA的标准检测方法。如果将来HBV RNA成为新的临床检验指标,也往往需要同时检测HBV DNA和RNA,如果分别检测必定带来耗费更多人力、时间、试剂、耗材和检测样品等问题。另一方面,目前检测HBV RNA尚无公认的常规方法,既往文献中的检测手段均存在一定局限。例如本课题的研究证明了直接抽提RNA并用oligo d T或基因特异性引物（gene specific primer,GSP）反转录的定量PCR可能因为难以消除的HBV DNA污染而存在定量不准,并且即使用DNase消化RNA提取物中的DNA也无法完全排除HBV DNA的干扰。还有其它文献报道了利用Quantigene核酸定量、微滴式数字PCR（droplet digital PCR,dd PCRds）等新技术进行HBV RNA的检测,虽然具有高灵敏度、特异性等优点,但是由于需要先进且昂贵的配套设备,目前只适用于实验室研究,尚难以在临床得到普及和推广。本课题开发了一种新的利用双重荧光定量PCR同时检测核酸提取物中pgRNA和DNA的方法,在克服了以往检测HBV RNA方法容易受到HBV DNA污染局限的同时,实现了两项指标的双检,相较于分别检测HBV DNA和RNA,可节省一半以上时间,以及减少一半的样本量需求,并且我们证明了该检测体系具有较高的特异性、准确性。本课题共设计有两种检测策略,第一种是反转录后拷贝数相减法的定量策略,适用于检测细胞培养上清标本,理论上也适合用于血清的检测;第二种策略是针对第一种的改良,方法是特异性扩增带锚定序列的c DNA然后定量,该改良检测策略对于检测细胞培养上清和细胞标本都能够胜任。综上,本课题设计的检测方法可以同时定量检测核酸提取物中HBV DNA和HBV RNA且具有定量准确、特异性好等优点,另外操作简单,节约了时间和人力物力成本,需要的检测样本量较少,因此能够较好地满足临床检验需求,具有潜在的转化价值。
丁文斌[3]（2020）在《乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究》文中认为乙型肝炎病毒前基因组RNA（pregenomic RNA,pg RNA）作为乙肝病毒（Hepatitis B virus,HBV）的反转录模板以及HBV聚合酶蛋白（polymerase,Pol）和核心抗原（HBV core antigen,HBc Ag）的翻译模板,在HBV的生命周期中发挥了重要作用[1-3]。近年来相关研究发现慢性乙肝（Chronic Hepatitis B,CHB）患者的外周循环血中可以稳定的检测到HBV RNA,且血清HBV RNA主要以pg RNA的形式存在于CHB的外周循环中;在长期服用核苷类似物（Nucleoside analogs,NAs）抗病毒治疗,血清HBV DNA水平在临床上为阴性（即未检出）的CHB患者中,其血清pg RNA表达水平不但与肝内pg RNA水平呈正相关关系,还可以反映出CHB患者肝脏的炎症和纤维化程度[4,5]。此外,还有许多研究提出血清pg RNA可以作为一种潜在的生物学标志物,用于评价NAs抗病毒治疗效果,检测NAs治疗中的病毒突变以及指导NAs治疗的安全停药[6-10]。然而,pg RNA在HBV相关肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发生及进展过程中发挥了何种作用尚不明确。此外,相关研究报道α干扰素2a（Interferon-α-2a,IFN-α-2a）可以抑制pg RNA的转录,且在HBV相关HCC行根治性手术的患者中,术后IFN-α-2a辅助治疗能够降低他们HCC的复发率并提高总体生存率,但具体作用机制仍不明确[11-13]。在本研究中,我们首先探索了pg RNA在HBV相关HCC发生和进展中的作用及机制。其次,我们探索了干扰IFN-α-2a除了直接抗肿瘤作用外,能否通过抑制pg RNA发挥预防HBV相关HCC发生和进展的作用。本研究分为以下两个部分。本研究的第一部分中,我们首先从本中心临床样本库中选取了136例术前服用NAs药物抗病毒治疗至少48周,血清HBV DNA阴性的慢乙肝肝癌患者,对其术前的血清,术中切除的肝癌及癌旁组织中pg RNA的表达量进行检测。结果显示癌旁组织中pg RNA的表达高于癌组织,且血清pg RNA表达与癌旁组织pg RNA表达呈正相关关系（r=0.63,p<0.001）。接下来我们根据患者血清pg RNA的表达水平,使用中位数法把患者分为血清pg RNA高表达组和血清pg RNA低表达组,然后对其基本临床病理学信息进行分析和比较。结果显示血清pg RNA高表达不但与更低的肿瘤分化程度（p=0.014）,更严重的肝脏炎症程度（p=0.006）,纤维化程度（p=0.013）及肝硬化（p=0.040）相关,而且还与HBV e抗原（HBV e antigen,HBe Ag）阳性（p=0.004）和HBV表面抗原（HBV surface antigen,HBs Ag）滴度（p=0.007）密切相关。此外,血清pg RNA高表达在患者的总生存期（Overall survival,OS）更短（p=0.0166）,肝癌的累计复发率（Cumulative recurrence rate,CRR）更高（p=0.0157）。多因素分析表明血清pg RNA高表达是肝癌患者手术后死亡（OS:95%CI=1.197-3.356,p=0.008）和肝癌复发的独立危险因素（CRR:95%CI=1.167-3.058,p=0.010）。对临床数据的分析提示pg RNA可能在HCC发生和进展中发挥了重要作用。接下来我们通过体内体外等功能实验进一步探索pg RNA在肝癌发生和进展中的作用。我们使用pg RNA特异性短发卡RNA（sh-RNA）成功构建了稳定干扰pg RNA的Hep G2.2.15肝癌细胞系。同时,我们使用pg RNA全长过表达质粒成功在肝癌细胞Hep G2.2.15和Huh7中过表达了pg RNA并挑取了稳定过表达单克隆。Cell Counting Kit-8（CCK-8）,克隆形成,Ed U,细胞流式,成球及体内和体外绝对稀释等实验表明敲低pg RNA的表达能够抑制细胞的增殖能力,克隆形成能力,抑制肝癌细胞的抗细胞凋亡能力,同时抑制肝癌细胞的干细胞特性（简称干性）和成瘤能力;而在肝癌细胞中过表达pg RNA后,肝癌细胞的增殖能力,克隆形成能力,抗凋亡能力,干性及成瘤能力进一步增强。体内外功能实验结果进一步证明了pg RNA与HCC的发生及进展密切相关。在探索pg RNA促进HBV相关HCC发生和进展的机制研究过程中,通过RNA pull-down实验[14],银染实验和蛋白质谱分析,我们发现pg RNA可与一个经典的促癌分子胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白3（Insulin-like growth factor 2 m RNA binding protein 3,IGF2BP3）直接结合并相互调节。接下来,我们又通过RNA pull-down和蛋白免疫印迹（Western blot）,RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation,RIP）及免疫荧光（Immunofluorescence,IF）和RNA原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）共聚焦等实验进一步验证了pg RNA与IGF2BP3的直接相互结合作用,且两者结合后pg RNA的稳定性得到增强。接下来,通过一系列的实验和生物信息学预测分析,我们发现pg RNA通过海绵样吸附mi RNA-let-7e-5p,在转录后修饰水平上调IGF2BP3的表达。此外,通过细胞功能的加减法实验,我们发现过表达pg RNA对肝癌增殖能力和干性的促进作用可以被进一步干扰IGF2BP3所阻断。总之,我们的研究发现在CHB患者体内,pg RNA与IGF2BP3之间存在相互调节作用。一方面,pg RNA与IGF2BP3直接结合,且两者结合后pg RNA的稳定性会升高;另一方面,pg RNA可通过海绵样吸附作用,隔离IGF2BP3抑制性的mi R-let-7e-5p,增加IGF2BP3 m RNA的稳定性,从而在转录后修饰水平上调IGF2BP3蛋白的表达。综上所述,我们第一部分部分的研究发现pg RNA-IGF2BP3信号轴在HBV相关HCC发生和进展过程中发挥了重要作用。本研究的第二部分中,我们探索IFN-α-2a能否通过抑制HBV-pg RNA,进而抑制HBV相关HCC的发生和进展。我们使用IFN-α-2a处理Hep G2.2.15肝癌细胞不同的时间段后,对pg RNA和IGF2BP3的表达变化进行检测。结果显示,当我们使用IFN-α-2a处理细胞0-24 h时,pg RNA和IGF2BP3 m RNA的表达从处理4 h后开始明显下降,但IGF2BP3蛋白水平未明显变化。接下来,我们使用IFN-α-2a处理细胞更长的时间（0-7天）,结果显示pg RNA和IGF2BP3的m RNA的表达水平从处理4 h起开始明显下降,IGF2BP3蛋白水平从处理24 h后开始明显下降。此外,当我们用IFN-α-2a处理不表达pg RNA但遗传背景与Hep G2.2.15相同的Hep G2细胞相同时间后,IGF2BP3无论在m RNA还是蛋白水平均未发生明显变化。这些结果提示IFN-α-2a无法直接下调IGF2BP3的表达,而是通过抑制pg RNA进而下调IGF2BP3的表达,发挥抑制HCC进展的作用。接下来,我们通过体内体外细胞功能加减法实验进一步验证IFN-α-2a是否通过抑制pg RNA发挥抑制HCC发生和复发的作用。首先,我们使用IFN-α-2a和等体积生理盐水分别处理pg RNA过表达单克隆和对应的阴性对照单克隆细胞。结果显示pg RNA的过表达可以在一定程度上逆转IFN-α-2a对肝癌细胞增殖能力和干性的抑制作用。接下来,我们使用pg RNA过表达单克隆和对应阴性对照单克隆细胞构建裸鼠皮下荷瘤模型,并使用IFN-α-2a或等体积生理盐水分别处理相应的裸鼠。结果显示过表达pg RNA后可以部分逆转IFN-α-2a对皮下荷瘤生长的抑制作用。综上,这些结果提示IFN-α-2a除了直接抗肿瘤生长作用外,在HBV相关HCC中还可以通过阻断pg RNA-IGF2BP3轴从而抑制肝癌细胞的增殖能力和干性,最终发挥抑制HCC进展的作用。相关研究已发现IFN-α-2a可以抑制pg RNA的转录[15]。此外,最近的研究也发现在HBV pg RNA的5’和3’末端茎环结构上存在N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）修饰位点,且m6A修饰程度增强后,HBV的所有转录本（包括pg RNA）的稳定性及相应的翻译产物会被下调[16]。因此,我们接下来探索IFN-α-2a处理对pg RNA稳定性及其m6A修饰的影响。通过放线菌素D（Actinomycin D）转录抑制实验并进一步计算pg RNA半衰期,我们发现经IFN-α-2a处理48 h后,pg RNA的稳定性明显下调。接下来我们通过基因特异性m6A q PCR,进一步验证IFN-α-2a处理对pg RNA的m6A修饰的影响。结果显示,IFN-α-2a处理能够明显增加pg RNA的m6A修饰水平。同时我们也检测了经IFN-α-2a处理后,m6A修饰过程中三个重要蛋白甲基转移酶样蛋白（Methyltransferase-like protein 3,METTL3）,甲基转移酶样蛋白（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）以及脂肪和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）的表达变化[17]。结果显示,经IFN-α-2a处理的Hep G2.2.15细胞中METTL3和METTL14的表达明显升高,而FTO的表达明显下降。提示IFN-α-2a可能通过上调肝癌细胞中甲基转移酶METTL3和METTL14的表达同时下调去甲基酶FTO的表达,进而增加pg RNA的m6A修饰水平。综上所述,我们该部分的研究发现IFN-α-2a除了直接的抗肿瘤作用外,在HBV相关HCC中还可以通过增加HBV-pg RNA的m6A修饰水平,促进pg RNA的降解,从而抑制pg RNA-IGF2BP3信号轴,发挥预防HCC发展的作用。
吕菲南[4]（2020）在《新型血清学标志在HBV感染者及HBV合并HIV感染者中的检测价值》文中研究指明目的目前,乙肝新型血清学标志物广泛应用,但是其在人类免疫缺陷病毒-乙型肝炎病毒（HIV-HBV）合并感染患者中的检测价值鲜有报道。在此,我们的主要目的是探究HIV-HBV共感染患者以及乙型肝炎病毒（HBV）感染患者,HBV-RNA、HBcrAg表达差异、临床生化学表达差异性,以及HBcrAg、HBV-RNA与HBV-DNA、HBs Ag之间的相关性。方法我们招募于2016年9月至2019年3月在天津市第二人民医院进行就诊的未经抗病毒治疗的HBV感染患者51例,以及未经抗病毒治疗33例HBV-HIV共感染患者,并搜集人口学资料、临床生化指标以及病毒学指标,经患者签署知情同意后留取患者剩余血清标本,使用CLEA法检测血清中HBcrAg含量,定量聚合酶链反应法检测血清中HBV-RNA含量。所有的数据使用SPSS17进行分析,P值小于0.05代表差异有统计学意义。结果1.本实验纳入研究对象为未经抗病毒治疗HBV感染患者51例,以及未经抗病毒治疗33例HIV-HBV共感染患者,其中HBV感染组男性34例,女性17例;HIV-HBV感染组男性29例,女性4例。HBV感染组ALT水平高于HIV-HBV共感染组（71 U/L vs 27 U/L,P<0.001）,HBV感染组AST水平高于HIV-HBV感染组,（60 U/L vs 23 U/L,P<0.001）,其余HBV-DNA、HBV-RNA、HBcrAg、HBs Ag在两组之间表达水平未见统计学差异。2.对于HBV感染者,结果显示HBcrAg和HBs Ag具有中度相关性（r=0.512,P<0.001）,与HBV-DNA强相关（r=0.802,P<0.001）,与HBV-RNA呈强相关性（r=0.727,P<0.001）;HBV-RNA与HBs Ag呈中度相关（r=0.454,P=0.001）,与HBV-DNA呈中度相关性(r=0.62,P<0.001;HBV-DNA与HBs Ag具有中度相关性（r=0.552,P<0.001）。3.在HBV-HIV共感染患者中,HBcrAg和HBs Ag具有强相关性（r=0.838,P<0.001）,与HBV-DNA强相关（r=0.751,P<0.001）,与HBV-RNA呈强相关性（r=0.734,P<0.001）;HBV-RNA与HBs Ag呈中度相关（r=0626,P<0.001）,与HBV-DNA呈强相关性（r=0.7,P<0.001）;HBV-DNA与HBs Ag具有中度相关性（r=0.641,P<0.001）。4.对于HBe Ag（+）的HBV患者,HBcrAg和HBs Ag具有强相关性（r=0.709,P<0.001）,与HBV-DNA强相关（r=0.801,P<0.001）,与HBV-RNA呈中度相关性（r=0.698,P<0.001）;HBV-RNA与HBs Ag呈中度相关（r=0.48,P=0.004）,与HBV-DNA呈中度相关性（r=0.686,P<0.001）;HBV-DNA与HBs Ag具有强相关性（r=0.709,P<0.001）。5.对于HBe Ag（-）的HBV患者,HBcrAg和HBs Ag未见相关性（r=-0.088,P=0.765）,与HBV-DNA未见相关（r=0.266,P=0.358）,与HBV-RNA呈中度相关性（r=0.688,P=0.007）;HBV-RNA与HBs Ag未见相关（r=0.211,P=0.446）,与HBV-DNA呈中度相关性（r=0.609,P=0.021）;HBV-DNA与HBs Ag未见相关（r=0.062,P=0.834）。6.对于HBe Ag（+）的HIV-HBV共感染患者,HBcrAg和HBs Ag具有强相关性（r=0.725,P<0.001）,与HBV-DNA未见相关（r=0.403,P=0.078）,与HBV-RNA亦未见相关性（r=0.307,P=0.188）;HBV-RNA与HBs Ag未见相关（r=0.293,P=0.211）,与HBV-DNA亦未见相关性（r=0.381,P=0.095）;HBV-DNA与HBs Ag未见相关（r=0.393,P=0.087）。7.对于HBe Ag（-）的HIV-HBV共感染患者,HBcrAg和HBs Ag中度相关（r=0.558,P=0.048）,与HBV-DNA未见相关（r=0.375,P=0.206）,与HBV-RNA呈中度相关性（r=0.683,P=0.001）;HBV-RNA与HBs Ag未见相关（r=0.265,P=0.382）,与HBV-DNA呈中度相关性（r=0.531,P=0.062）;HBV-DNA与HBs Ag未见相关（r=0.114,P=0.71）。8.对于CD4≥250/mm3的HBV-HIV共感染组,HBcrAg和HBs Ag强相关（r=0.886,P<0.001）,与HBV-DNA强相关（r=0.817,P<0.001）,与HBV-RNA也呈强相关性（r=0.723,P<0.001）;HBV-RNA与HBs Ag中度相关（r=0.649,P=0.003）,与HBV-DNA呈强度相关性（r=0.765,P<0.001）;HBV-DNA与HBs Ag呈强相关（r=0.791,P<0.001）。9.对于CD4<250/mm3的HBV-HIV共感染组,HBcrAg和HBs Ag强相关（r=0.829,P<0.001）,与HBV-DNA强相关（r=0.74,P=0.002）,与HBV-RNA也呈强相关性（r=0.772,P=0.001）;HBV RNA与HBs Ag强相关（r=0.751,P=0.002）,与HBV-DNA呈中度相关性（r=0.581,P<0.029）;HBV-DNA与HBs Ag呈中度相关（r=0.602,P=0.023）。结论:1、对于HIV-HBV共感染患者,HBcrAg与HBs Ag、HBV-DNA、HBV-RNA均具有强相关性,HBV-RNA与HBs Ag、HBV-DNA也具有相关性,HBcrAg、HBV-RNA均可作为监测HBV-HIV共感染患者肝脏疾病过程的良好标志物。2、无论CD4+T淋巴细胞计数水平高低,HBcrAg与HBs Ag、HBV-DNA、HBV-RNA均具有相关性,HBV-RNA与HBs Ag、HBV-DNA也具有相关性,HBcrAg、HBV-RNA对于监测HBV-HIV共感染患者肝脏HBV的活动,无关免疫状态。
孙鑫[5]（2019）在《基于肝脏自然杀伤细胞与肝星状细胞的关系探讨扶正化瘀方联合恩替卡韦有效逆转乙肝肝硬化的免疫调节机制》文中进行了进一步梳理目的:观察肝脏自然杀伤细胞在乙肝肝硬化及肝癌临床肝组织样本中的表型变化特点,寻找乙肝肝硬化及肝癌中肝内NK细胞的相关病理分子;体内动物实验比较分析中药扶正化瘀方联合抗病毒药物恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝脏自然杀伤细胞的免疫调控作用,进一步体内清除NK细胞后,观察联合用药方案对抗乙肝背景肝纤维化药效的影响;体外探讨说明中药扶正化瘀方通过提高NK细胞对HSC的识别杀伤活性,抑制HSC活化的抗肝纤维化的免疫调控机制。本论文分为四个部分。方法:1、收集2017年11月至2018年10月期间在上海交通大学附属仁济医院肝移植中心行外科手术住院患者的肝组织样本以及术前临床基线资料,HE及天狼猩红病理染色观察肝组织炎症及纤维化程度,采用流式细胞术检测各肝组织样本中NK细胞的数量、亚型以及表面激活型受体NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46的表达,Pearson相关性分析探索NK细胞数量、亚型及表面激活型受体的表达与相应临床基线资料实验室指标之间的相关性,以及其与肝纤维化天狼猩红染色面积参数的相关性,通过免疫组化双重染色技术对激活型NK细胞与活化HSC进行共定位,观察不同组别的共表达差异。2、采用HBV转基因小鼠复合10%CCl4腹腔注射诱导乙肝背景肝纤维化小鼠模型,以野生型小鼠及单纯HBV转基因小鼠为对照,造模2周后给予扶正化瘀方、恩替卡韦、扶正化瘀方联合恩替卡韦干预并继续造模4周,观察小鼠的一般情况,计算脏器指数,检测小鼠血清HBs Ag、HBe Ag、HBV-DNA及肝组织HBs Ag、HBc Ag病毒学指标,ALT、AST、AKP、TBil、Alb等血清肝功能生化指标,观察肝组织炎症及纤维化病理学变化,检测肝组织羟脯氨酸的含量,流式细胞术检测肝内淋巴细胞亚群变化以及NK表面激活型受体NKG2D的表达特点,免疫荧光染色观察HSC活化与静止状态下的NKG2D配体RAE-1分子的表达差异。3、同上方法制备乙肝背景肝纤维化小鼠模型,同时采用ASGM1腹腔注射清除体内NK细胞,以同基因背景野生型小鼠为对照,设复合模型+Rabbit Ig G组、复合模型+Anti-ASGM1组、扶正化瘀方联合恩替卡韦干预+Rabbit Ig G组、扶正化瘀方联合恩替卡韦干预+Anti-ASGM1组,10%CCl4腹腔注射造模同时并灌胃给药干预4周,记录小鼠体重及一般情况,计算脏器指数,检测小鼠血清HBs Ag、HBe Ag、HBV-DNA病毒学指标,ALT、AST、AKP血清肝功能生化指标,流式细胞术检测肝内NK细胞清除情况以及观察NK细胞清除后肝内主要淋巴细胞亚群的变化,以HE和天狼猩红病理染色评价肝组织炎症及纤维化程度,结合肝组织羟脯氨酸的含量评价抗肝纤维化药效。4、体外以人外周血来源的NK92细胞株和人肝星状细胞株LX-2为研究对象,首先采用CCK8法测定扶正化瘀方对NK92及LX-2的最大无毒浓度,在无毒浓度范围选择3～5个药物浓度进行NK92细胞功能和活性的评价,Annexin V/7-AAD复染法检测NK92细胞凋亡,荧光定量PCR检测药物孵育NK92细胞株8h和16h后表面激活型受体NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46的m RNA水平,流式细胞术检测并验证NK92细胞表面分子NKG2D的表达变化,ELISA法检测药物孵育NK92后其细胞因子IFN-γ和颗粒酶B的分泌水平,以聚肌胞苷酸Poly I:C为阳性对照药物,在NK92与K562共培养杀伤体系中评价药物对NK92细胞株杀伤功能的影响,最后以不同浓度扶正化瘀方预孵育的NK92细胞株与人肝星状细胞株LX-2共培养5h,流式细胞术检测NK92细胞表面激活型受体NKG2D的表达,细胞免疫荧光染色观察LX-2细胞的活化（α-SMA的表达）以及其对表面RAE-1分子的表达情况。结果:1、通过对正常供肝组9例、乙肝肝硬化组8例、乙肝肝癌组12例患者的临床术前基本资料统计分析和组间比较,发现三组人群平均年龄依次递增,乙肝肝硬化组较正常供肝组患者血红蛋白（Hb）明显降低,血小板计数（PLT）显着降低,中性粒细胞百分比明显升高,凝血酶原时间（PT）明显延长,凝血国际标准化比值（INR）明显增大;乙肝肝癌组较正常供肝组患者血小板计数（PLT）显着降低,中性粒细胞百分比显着升高,γ-谷酰胺转酞酶（γ-GGT）显着升高;乙肝肝癌组患者血小板计数（PLT）、γ-谷酰胺转酞酶（γ-GGT）均明显高于乙肝肝硬化组。通过病理观察,乙肝肝硬化组肝组织大量炎性细胞浸润,纤维化明显,乙肝肝癌组明显炎性细胞浸润伴弥漫性纤维化,部分样本仍可见癌细胞增生活跃。流式细胞术检测肝内NK细胞数量、亚型及表面激活型受体结果显示,与正常供肝组比较,乙肝肝硬化组肝内NK细胞比例明显降低,乙肝肝硬化组与乙肝肝癌组肝内NK细胞表面NKG2D分子表达均明显减少,乙肝肝癌组肝内NK细胞表面NKp46分子表达明显减少;乙肝肝癌组肝内NK细胞比例明显高于乙肝肝硬化组,NKp46的表达明显低于乙肝肝硬化组。Pearson相关性分析结果显示,肝内NK细胞占淋巴细胞的比例与患者血清白蛋白（Alb）水平呈正相关;肝内NK细胞表面激活型受体NKG2D、NKp44、NKp46的表达均与凝血酶原时间（PT）和凝血国际标准化比值（INR）呈负相关;NKG2D的表达水平还与肝组织天狼猩红阳性染色面积呈负相关。在乙肝肝硬化组和乙肝肝癌组免疫组化双染图像中可以看出,肝内NKp46的表达减少,且主要表达于α-SMA阳性染色区域周围,而正常供肝组肝组织α-SMA表达极少,NKp46表达散在分布。2、扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝脏自然杀伤细胞免疫调控的体内观察研究发现:与野生型对照组相比,单纯HBV转基因小鼠与HBV转基因复合CCl4模型组小鼠血清HBV-DNA载量均高于1×107IU/ml,血清及肝组织HBs Ag、血清HBe Ag和肝组织HBc Ag均呈阳性表达;与单纯HBV转基因组相比,HBV转基因复合CCl4模型组小鼠血清ALT、AST、AKP、TBil水平显着升高,血清Alb水平显着降低,肝组织细胞坏死,汇管区大量炎症细胞浸润,胶原纤维增生明显,羟脯氨酸含量显着升高,α-SMA和I型胶原表达显着增多,肝内B细胞占淋巴细胞比例升高,NK细胞及NKT细胞占比显着降低,CD4+T细胞占T淋巴细胞比例显着降低,CD8+T细胞占比显着升高,NK细胞表面NKG2D分子表达减少,肝组织RAE-1表达显着减少。与HBV转基因复合CCl4模型组相比,恩替卡韦组、扶正化瘀方组、扶正化瘀方联合恩替卡韦组小鼠血清HBV-DNA载量、HBe Ag水平以及肝功能ALT、AST、AKP、TBil水平均不同程度降低,恩替卡韦组纤维化指标没有明显改善,三组肝内淋巴细胞亚群比例变化均有不同程度改变,其中,恩替卡韦组、扶正化瘀方组、扶正化瘀方联合恩替卡韦组小鼠肝内NK细胞占淋巴细胞比例依次显着增高,NK细胞表面NKG2D分子表达依次增多,扶正化瘀方以及扶正化瘀方联合恩替卡韦组小鼠肝组织RAE-1表达均显着增加。3、体内清除NK细胞后,扶正化瘀方联合恩替卡韦抗乙肝背景小鼠肝纤维化药效观察研究显示:与野生型对照组相比,复合模型+Rabbit Ig G组肝内NK细胞占淋巴细胞比例显着降低,血清HBV-DNA载量高于1×106IU/ml,HBs Ag、HBe Ag均呈阳性表达,ALT、AST、AKP水平显着升高,肝组织大量炎性细胞浸润伴局部坏死、肝细胞气球样变及脂肪变,明显胶原沉积,羟脯氨酸含量增高,肝内免疫细胞群比例紊乱;与复合模型+Rabbit Ig G组相比,复合模型+Anti-ASGM1组肝内NK细胞占比减少更为明显,天狼猩红染色纤维化区域和羟脯氨酸含量均有增加的趋势,而扶正化瘀方联合恩替卡韦干预+Rabbit Ig G组肝内NK细胞占比显着增加,血清HBV-DNA载量和肝功能生化指标均显着降低,肝组织炎症及纤维化明显减轻,羟脯氨酸含量显着减少;与复合模型+Anti-ASGM1组相比,扶正化瘀方联合恩替卡韦干预+Anti-ASGM1组肝内NK细胞占比增加,血清HBV-DNA载量和肝功能生化指标均显着降低,肝纤维化程度轻微改善,羟脯氨酸含量呈现减少的趋势。4、扶正化瘀方体外调节NK细胞杀伤功能的抗HSC活化的作用机制研究发现:扶正化瘀方在100μg/ml及以下的浓度对NK92和LX-2细胞株均无明显毒性,较低浓度（0.1～10μg/ml）的扶正化瘀方对NK92细胞凋亡有保护作用,不同浓度的扶正化瘀方孵育NK92细胞株16h,可不同程度增强NK细胞表面激活型受体NKG2D、NKp30、NKp46的表达以及促进IFN-γ的分泌,扶正化瘀方在无毒浓度范围可呈现剂量依赖性地提高NK92细胞对K562细胞的杀伤功能,预孵育扶正化瘀方的NK92细胞株与LX-2共培养5h后,NK92细胞表面NKG2D分子表达上调,同时LX-2表面RAE-1分子表达增强,α-SMA表达减少。结论:1、乙肝肝硬化及肝癌患者肝内NK细胞数量和功能受到抑制,主要表现在肝内NK细胞表面激活型受体NKG2D及NKp46表达下调,并通过相关性分析发现其表达与PT和INR水平呈负相关,尤其是NKG2D的表达与肝纤维化程度呈负相关。2、扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠具有抗病毒抗肝纤维化协同治疗的作用,且可纠正乙肝肝纤维化小鼠肝内淋巴细胞免疫紊乱,其抗乙肝肝纤维化的作用可能与恢复NK细胞的数量和功能、增强NKG2D（NK）-RAE-1（HSC）的有效应答有关。3、体内注射Anti-ASGM1清除NK细胞后,肝内NK细胞数量显着减少,肝纤维化进一步加重,扶正化瘀方联合恩替卡韦能够拮抗Anti-ASGM1对该复合模型肝内NK细胞的抑制作用。同时抑制肝内NK细胞的数量和功能,限制了该联合用药方案改善肝纤维化的作用效果。4、扶正化瘀方对NK细胞的功能有正性调节作用,可通过增强NK细胞与HSC细胞表面分子NKG2D-RAE-1的直接接触途径抑制HSC的活化,从而发挥抗肝纤维化的作用。
杨以通[6]（2019）在《LSD1在乙肝相关性肾炎肾小管间质炎症中的作用研究》文中研究表明目的:乙型肝炎病毒相关性肾炎（Hepatitis B virus-related glomerulonephritis,HBV-GN）发生机制不清,尚缺乏有效手段延缓其进展。我国是慢性乙型肝炎发病率较高的国家,HBV-GN已成为我国主要的继发性肾脏病之一。近年来研究证实,HBV感染可直接引起肾小管上皮细胞损伤、小管间质炎症细胞浸润,最终进展为肾小管间质纤维化,但具体机制仍不清楚。赖氨酸特异性去甲基化酶1（Lysine-specific demethylase 1,LSD1）是第一个被发现的组蛋白去甲基化酶,能够特异性脱去单甲基化和二甲基化组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4me1/2）和H3K9me1/2位点上的甲基基团,从而调节靶基因的转录活性。研究发现,LSD1通过介导上述组蛋白去甲基化调控免疫及炎症相关基因的表达,参与免疫、炎症反应。本研究旨在通过体内、外实验,观察LSD1在HBV诱导的肾小管间质炎症形成中的作用,并探讨可能的作用机制。方法:（1）收集2015年01月2017年12月在上海交通大学附属第一人民医院等3家三甲医院经病史、临床检查及肾穿刺活检病理诊断为HBV-GN患者53例,既往无其它肾脏病史,以35例单纯血清HBV阳性原发性肾小球肾炎（Primary glomerulonephritis,PGN）患者、50例血清HBV阴性PGN患者肾组织以及15例肾肿瘤患者癌旁正常肾组织做为对照组。采用免疫荧光双标检测肾组织HBsAg与LSD1共表达;免疫组化检测肾组织炎症标志物、LSD1表达,并分析二者之间的关系。（2）用含1.3倍全长HBV基因组的质粒（pCMV-HBV-1.3）转染人近端肾小管上皮细胞（HK-2）,建立HBV感染细胞模型。采用Realtime RT-PCR及ELISA检测促炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1表达和分泌;Realtime RT-PCR及Western blot检测LSD1表达。构建pcDNA3.1-myc-LSD1及LSD1shRNA质粒,转染上述细胞模型,采用Realtime RT-PCR及ELISA检测上述促炎症介质表达和分泌。（3）采用RNA-seq检测LSD1沉默前后差异表达的基因;Western blot检测LSD1沉默前后H3K4me1/2、H3K9me1/2、TLR4表达;染色质免疫共沉淀（ChIP）检测各组HK-2细胞中TLR4基因启动子上LSD1、H3K4me1/2、H3K9me1/2表达。构建pcDNA3.1-myc-TLR4及TLR4 shRNA质粒,与LSD1shRNA质粒共转染HBV感染的HK-2细胞。采用ELISA检测IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1分泌;Western blot检测HK-2细胞TLR4下游NF-κB和MAPK信号通路活化情况。经NF-κΒ和MAPK抑制剂干预后,检测上述促炎症介质分泌。结果:（1）与对照组相比,HBV-GN患者肾小管间质CD4+T细胞及巨噬细胞浸润明显,且肾小管上皮细胞IL-1β、IL-6、MCP-1及LSD1表达上调。在LSD1的分布区域可见有HBsAg分布,LSD1的表达强度与HBsAg的强度相近。进一步研究发现,HBV-GN患者LSD1表达程度与肾小管及间质病变程度相关,与间质炎性细胞浸润、肾小管萎缩及肾间质纤维化最为密切。（2）转染HBV基因组的HK-2细胞培养上清中可见HBV DNA、HBsAg以及HBeAg表达,提示HBV感染HK-2细胞模型构建成功。HBV感染后,HK-2细胞IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1表达和分泌均增加,且LSD1表达上调。经LSD1过表达或沉默干预后,HK-2细胞IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1表达和分泌均相应增加或减少。（3）RNA-seq分析发现,LSD1沉默后共有983个基因显示其丰度增加超过1.5倍（表达上调）,而557个基因则显示其丰度下降超过1.5倍（表达下调）,并且上述许多基因参与了炎症反应过程。此外,在表达差异最大的上述基因中,许多着名基因也都与炎症有关,例如TLR4、IL-1β、TNFAIP3及SOCS2等。进一步研究发现,LSD1不能结合到IL-1β和IL-6基因启动子上直接调控它们表达;而LSD1能结合到TLR4基因启动子上介导H3K9me1/2而非H3K4me1/2去甲基化,进而直接调控其表达;沉默TLR4可抑制HBV诱导的HK-2细胞促炎症介质分泌,且过表达TLR4可恢复LSD1沉默诱导的促炎症介质分泌减少;沉默LSD1可抑制HBV诱导的IKKα/β、IκBα、JNK1/2、ERK1/2及p38MAPK蛋白磷酸化,而过表达TLR4可恢复上述蛋白磷酸化。NF-κB或JNK抑制剂能够抑制HBV诱导的HK-2细胞促炎症介质分泌。结论:（1）HBV-GN患者肾组织（主要是肾小管）中LSD1表达上调,且其表达程度与肾小管及间质炎症损伤密切相关,提示LSD1可能与HBV-GN肾间质炎症反应有关。（2）HBV感染HK-2细胞模型构建成功;HBV可诱导HK-2细胞促炎症介质分泌以及LSD1表达上调;过表达/沉默LSD1可促进/抑制HBV诱导的HK-2细胞促炎症介质分泌,这一过程可能依赖LSD1的组蛋白去甲基化作用。（3）RNA-seq分析发现TLR4是LSD1的下游靶基因;LSD1可直接结合到TLR4基因启动子上介导H3K9me1/2去甲基化,进而调控其表达;LSD1遂通过直接调控TLR4的表达介导NF-κB和JNK通路活化,从而促进HBV诱导的HK-2细胞促炎症介质分泌。
徐亮[7]（2019）在《应用高灵敏方法评估现行HBV母婴阻断方案研究》文中进行了进一步梳理目的采用高灵敏方法评估实施乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）母婴阻断后孩子发生隐匿性HBV感染（Occult HBV infection,OBI）的现状、探讨孩子发生OBI的相关危险因素及对母亲的影响。方法研究分三部分,第一部分为现行HBV母婴阻断方案实施后子代乙肝病毒标志物的随访、变化分析;第二部分对经过HBV母婴阻断的孩子进行7月-24月的随访,应用nested PCR检测其外周血中HBV DNA、HBV RNA的基因表达,以评估现行HBV母婴阻断方案疗效。第三部分为实施HBV母婴阻断的HBsAg阳性母亲分娩后1年内肝功能、HBV DNA变化的随访研究。结果按照我国现行HBV母婴阻断疗效评估标准,51例HBsAg阳性母亲所生孩子HBsAg、HBV DNA均阴性,HBV阻断成功率为100%。对其中随访资料相对完整的13对母子外周血进行nested PCR检测,证实诊断为OBI的孩子多达11例,结果发现HBeAg阳性母亲所生孩子发生OBI的几率明显高于HBeAg阴性母亲所生孩子,χ2=5.318,P=0.021;脐带血PBMC细胞中HBV基因检测结果与母亲外周血PBMC细胞一致,而脐带血血浆中未能检测出HBV基因;HBV血清标志物仅抗-HBs阳性的7例孩子中有5例可以检测HBV基因。HBsAg阳性母亲所生孩子的抗HBs水平在出生2月时升高,阳性率高达96.1%;HBeAg阳性率在出生2天时高达54%,12月时全部阴转;HBeAb阳性率在出生2天时高达50%,在24月时仅剩1例阳性;Anti-HBc出生时阳性率100%,随后逐渐下降,但在24月时反跳至91.9%。将母亲分娩前HBV DNA分为HBV DNA<500 Copies/mL,HBV DNA≥500 Copies/mL且<10^6 Copies/mL,以及HBV DNA≥10^6 Copies/mL三组,发现孩子HBeAg阳性率在出生2天、2月时分别为22.7%、63.6%、93.3%和0、36.4%、36.4%,HBeAb阳性率在孩子2天、2月、7月时分别为77.3%、45.5%、13.3%,65.2%、27.3%、6.7%及36.8%、11.1%、0%,均P<0.01。分娩前HBeAg阳性母亲所生孩子出生2天、2月的HBeAg阳性率分别为85.2%、33.3%,明显高于HBeAg阴性母亲所生孩子的7.1%、0%,均P<0.01;其HBeAb阳性率分别为18.5%、3.7%、0%,明显低于HBeAg阴性母亲所生孩子的100%、100%、60%,均P<0.01。孩子出生2天肝功能异常比较常见,轻度肝功能异常（ALT和或AST>40 U/L且<80 U/L）47.1%,肝功能明显异常（80 U/L<ALT和或AST）占35.2%,但无肝衰竭病例发生,且多无需特殊治疗。对母亲产后随访1年,肝功能异常率为33.3%（17/51）,肝炎发生率为27.4%（14/51）。将母亲分为替比夫定（Telbivudine,LdT）组及非LdT组,进行肝功能异常率比较,LdT组为60%（6/10）,非LdT组26.8%（11/41）,其中明显肝功能异常者LdT组仅10%（1/10）,非LdT组为7.3%（3/41）;肝炎发生率,LdT组为40%,非LdT组为24.4%,两组比较均P>0.05。两组肝炎发作均在3月内,且均未出现TBIL的升高。10例停用LdT母亲在1年内有6例发生HBV DNA反弹,主要发生在产后3月内（5/6）,其中4例发生肝炎。HBeAg阳性母亲肝炎发生率为33.3%,显着高于HBeAg阴性母亲的8.3%,χ2=4.694,P=0.032;HBV DNA≥10^6 Cs/mL母亲肝炎的发生率53.3%,也显着高于HBV DNA<10^6 Cs/mL母亲的8.3%,χ2=12.675,P=0.001。多元线性回归分析显示母亲是否发生肝炎仅与分娩前log10 HBV DNA呈显着相关性（β系数=0.507,t=2.747,P=0.009）。结论按照现行HBV母婴阻断评估标准,HBV母婴阻断“成功”的13例孩子有11例发生OBI,应引起临床重视;母亲HBeAg阳性是孩子发生OBI的危险因素;脐带血PBMC细胞可能是母婴传播OBI的一个重要途径;孩子HBV血清标志物仅抗-HBs阳性并不能排除OBI。孩子出生后HBeAg、HBeAb的表达主要受母亲HBV DNA水平及HBeAg的影响,12月内HBeAg、HBeAb、抗-HBc考虑主要来自于母体。HBsAg阳性母亲分娩后停用LdT发生HBV DNA反弹、肝炎发作比较常见,多在产后3月内,所以分娩后3月内是监测肝功能、HBV DNA水平的关键时期,分娩前HBeAg阳性、HBV DNA水平≥10^6 Cs/mL是发生肝炎的危险因素。
王明,张抒,李明,文君,郑振江[8]（2019）在《慢性乙型肝炎患者血清与粪便HBV DNA水平对比研究》文中研究表明目的分析慢性乙型肝炎（CHB）患者血清和粪便HBV DNA与血生化指标和肠道菌群的相关性。方法 2015年8月～2017年3月在我院就诊的CHB患者73例,常规检测血生化、HBV标记物和HBV DNA水平,同时收集粪便,测量HBV DNA及双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌、梭菌属、白色念珠菌、拟杆菌、普雷沃氏菌、瘤胃球菌等9种肠道菌群DNA,比较血清和粪便HBV DNA与肝功能和肠道菌群DNA的相关性。结果 48例血清HBeAg阳性患者粪便和血清HBV DNA水平分别为（5.9±1.6） copies/ml和（7.2±1.6） copies/ml,均显着高于25例血清HBeAg阴性组的（5.0±1.9） copies/ml和（6.1±1.3） copies/ml （t=4.401,P=0.024;t=5.936,P=0.008）;21例轻度、47例中度和5例重度CHB患者粪便和血清HBV DNA定量水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）;粪便HBV DNA与血清HBV DNA水平呈正相关（r=0.61,P=0.002）,与血清ALP和TBIL水平呈负相关（r=-0.49,r=-0.54,P<0.05）,而血清HBV DNA与血清ALT或AST水平呈负相关（r=-0.46,P=0.023;r=-0.52,P=0.008）;粪便HBV DNA与肠球菌呈正相关（r=0.49,P=0.005）,而血清HBV DNA与乳酸杆菌呈负相关（r=-0.53,P<0.001）,其余肠道菌群与HBV DNA无明显相关性（P>0.05）。结论 CHB患者粪便存在HBV DNA,其检测的意义还有待于进一步探讨。
叶爱珠[9]（2018）在《建立实时荧光定量PCR检测HBV感染者血清pgRNA水平及其临床意义》文中研究指明【目的】1建立实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,Real-Time qPCR）方法检测HBV感染者血清前基因组RNA（pregenomic RNA,pgRNA）水平,评价该方法的性能特点和临床意义;2监测不同临床结局HBV感染者的血清HBV pgRNA水平,分析血清HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性。【方法】1建立Real-Time qPCR方法检测血清中的pgRNA水平1.1 Real-Time qPCR建立设计特异性引物和探针、摸索反应体系和条件、构建质粒标准品、绘制标准曲线等。构建质粒标准品的步骤如下:提取HepG 2.2.15细胞上清液HBV RNA,将其逆转录成cDNA,用上下游引物对上述模板进行常规PCR扩增,PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证为目的片段后进行胶回收、纯化,然后与pEASY?-Blunt载体连接并转化至Trans1-T1感受态细胞中。筛选出阳性克隆,经菌落PCR、测序验证后,增菌抽提质粒。绘制标准曲线的步骤如下:以构建成功的质粒作为标准品,依据公式换算成拷贝数,用Easy Dilution Buffer将上述质粒准确稀释至1.0×1010 copies/ml,再以10倍倍比稀释得到1×1010 copies/ml1×101 copies/ml的10个系列浓度的标准品作为反应模板,采用StepOne plus型荧光定量PCR仪进行定量检测。以Ct值为纵坐标,不同浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线。1.2 Real-Time qPCR方法学评价用Real-Time qPCR方法对重组质粒标准品（1×10100 copies/ml1×101copies/ml）进行检测,评价其线性范围、灵敏性、特异性、重复性、准确性等。1.3 pgRNA的临床意义用自建方法检测不同临床结局HBV感染者血清的pgRNA水平,监测抗病毒药物对pgRNA水平的影响,从而为患者选择合适的停药时机、判断疗效提供参考。2.探讨不同临床结局HBV感染者血清HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性。2.1临床病例和检测指标收集就诊于福建医科大学附属第一医院就诊人群中接受NAs治疗的不同临床结局HBV感染者的血清400例,其中无症状乙型肝炎病毒携带者（asymptomatic hepatitis b virus carrier,ASC）组、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）组、肝硬化（liver cirrhosis,LC）组和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）组各100例。HBsAg阴性对照者、其它病毒感染者（包括丙肝患者、EB病毒感染者、单纯疱疹感染者）血清共15例。采用磁珠法提取HBV DNA,离心柱法抽提HBV RNA。采用Architect i4000微粒子化学发光免疫分析仪对HBV血清学标志物HBsAg、HBeAg水平进行定量检测;通过LightCycler 480荧光定量PCR仪对HBV DNA水平进行定量检测;采用StepOne plus型荧光定量PCR仪对血清HBV pgRNA水平进行定量检测。2.2相关性分析分析HBV感染者血清HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性,比较不同临床结局HBV感染者中ASC组、CHB组、LC组和HCC组两两之间其血清HBV pgRNA水平和HBV传统血清学标志物差异,从而为临床抗病毒治疗提供参考。【结果】1建立Real-Time qPCR方法检测血清中的pgRNA水平1.1成功建立Real-Time qPCR确定了该方法的反应条件;成功构建了质粒标准品以及绘制了标准曲线。1.2 Real-Time qPCR方法学评价Real-Time qPCR方法检测标准质粒的线性范围为1×10100 copies/ml1×103copies/ml;检测下限为1×103 copies/ml;批内变异系数在0.13%0.73%之间;批间变异系数在0.16%0.63%之间;该方法检测其它病毒感染者的血清HBV pgRNA水平均为阴性,说明该方法具有较好的特异性;用于评价该方法准确度的回收试验的平均回收率为93.785%,符合《中华人民共和国医药行业标准》的规定。1.3 pgRNA的临床意义用Real-Time qPCR方法检测不同临床结局HBV感染者的血清HBV pgRNA水平,同HBV DNA、HBsAg水平比较,分析结果发现,HBV pgRNA水平在ASC组和LC组、ASC组和HCC组、CHB组和LC组、CHB组和HCC组中均具有显着差异{[（4.32±2.36）copies/ml]vs.[（3.22±2.13）copies/ml],[（4.32±2.36）copies/ml]vs.[（3.14±2.12）copies/ml],[（4.41±2.51）copies/ml]vs.[（3.22±2.13）copies/ml],[（4.41±2.51）copies/ml]vs.[（3.14±2.12）copies/ml],均P<0.05};HBV DNA水平在ASC组和LC组、ASC组和HCC组、CHB组和LC组、CHB组和HCC组中均具有显着差异{[（4.42±1.72）copies/ml]vs.[（3.68±0.89）copies/ml],[（4.42±1.72）copies/ml]vs.[（3.64±0.65）copies/ml],[（4.7±1.77）copies/ml]vs.[（3.68±0.89）copies/ml],[（4.7±1.77）copies/ml]vs.[（3.64±0.65）copies/ml],均P<0.05};HBsAg水平在ASC组和LC组、ASC组和HCC组、CHB组和LC组、CHB组和HCC组中均具有显着差异{[（7393.32±16302.77）IU/ml]vs.[（1831.56±6005.84）IU/ml],[（7393.32±16302.77）IU/ml]vs.[1276.72±1697.07)IU/ml],[6157.9±11583.95)IU/ml]vs.[（1831.56±6005.84）IU/ml],[6157.9±11583.95)IU/ml]vs.[1276.72±1697.07)IU/ml],均P<0.05},提示在区别不同临床结局HBV感染者方面HBV pgRNA类比HBV传统血清学标志物有相似的临床意义。2探讨不同临床结局HBV感染者血清HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性收集接受NAs治疗的不同临床结局HBV感染者的血清400例,其中ASC组、CHB组、LC组和HCC组各100例。分析400例HBV感染者不同血清学指标HBV DNA、HBV pgRNA、HBsAg水平两两之间的相关性,发现HBV pgRNA水平和HBV DNA水平的相关性（r=0.58,P<0.001）相较于和HBsAg水平的相关性（r=0.47,P<0.001）良好,HBsAg水平和HBV DNA水平的相关性（r=0.45,P<0.001）良好。另外,我们还分别研究了HBeAg阳性和HBeAg阴性患者中HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性。结果发现HBV pgRNA水平和HBV DNA水平在HBeAg阳性组{[（5.04±2.49）copies/ml],[（4.85±1.97）copies/ml]}中均高于HBeAg阴性组{[（3.11±1.99）copies/ml],[（3.72±0.91）copies/ml]},差异显着（t=9.987,P<0.001;t=7.545,P<0.001）。HBV pgRNA和HBV DNA水平在HBeAg阳性组（r=0.57,P<0.001）和HBeAg阴性组（r=0.32,P<0.001）中均呈正相关,但前者相关性较后者良好。此外,我们对400例HBV感染者不同血清学指标统计分析发现,HBV DNA<500 IU/ml的标本中HBV pgRNA的检出率是78.9%,提示HBV DNA水平的高低和HBV pgRNA检出率是否有某种关联呢?进而我们从这些标本中选取了108例HBV DNA<500 IU/ml的标本,依据HBV DNA水平再细分为HBV DNA<20 IU/ml组（74例）和20 IU/ml<HBV DNA<500 IU/ml组（34例）,分析统计HBV pgRNA的检出率,两组检出率分别是17.57%（13/74）和41.18%（14/34）,即在HBV DNA<20 IU/ml组（74例）中82.43%（61/74）的HBV感染者的HBV DNA水平和HBV pgRNA水平皆低于检测下限。【结论】1成功建立定量检测HBV感染者血清HBV pgRNA水平的Real-Time qPCR方法。该方法具有较好的准确性、敏感性、特异性和较宽的线性范围,适合于临床实验室推广应用。2 HBV pgRNA水平与HBV DNA、HBsAg水平均具有良好的相关性;通过监测不同临床结局HBV感染者HBV pgRNA水平与HBV传统血清学标志物水平的动态变化,以了解HBV的感染状态、评价抗病毒治疗效果,有望为不同临床结局HBV感染者进展的判断提供新的、潜在的预测指标之一。
郑吉顺[10]（2016）在《慢性乙型肝炎患者肠道乙肝病毒DNA、菌群间比值、血清白细胞介素-17A～F的变化及肠道微生态制剂治疗的疗效研究》文中认为目的了解慢性乙型肝炎患者肠道HBV DNA、菌群间比值及血清白介素-17AF变化情况以及应用肠道微生态制剂治疗对肠道HBV DNA、菌群间比值、血清白介素-17AF变化以及肝功能变化的影响,探讨肠道微生态制剂治疗对慢性乙型肝炎疗效及可能的毒副作用。材料与方法选择66例慢性乙型肝炎患者,根据随机分组原则,对患者进行分组:常规治疗组（拉米夫定100mg qd,阿德福韦酯10mg qd;还原型谷胱苷肽1.8 qd,异甘草酸镁150mg qd,苦参素葡萄糖100ml qd。疗程14天后抗病毒治疗方案不变,根据肝功能情况予以调整护肝治疗方案）33例,微生态治疗组（在常规治疗组基础上同时加用酪酸梭菌二联活菌,每天6袋,每袋含酪酸梭菌活菌不低于1.0×107cfu/克、双歧杆菌活菌粉不低于1.0×106cfu/克）33例。分别收集66例患者治疗前及治疗后13±1天血清及粪便标本,同时收集30例健康志愿者血清及粪便标本。采用荧光定量PCR检测血清及粪便中HBV DNA、粪便中9种肠道菌群含量。分别对9种肠道菌群DNA拷贝数对数值进行两两间相除获得菌群间比值;酶联免疫吸附试验法检测血清细胞因子（IL-17AF、IL-1β、IL-6及CXCL-13）的浓度;全自动生化仪检测:总胆红素（TBIL）、白蛋白（ALB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）及谷氨酰转肽酶（GGT）。对慢性乙型肝炎患者治疗前进行HBV DNA、菌群间比值、血清白介素-17AF及肝功能变化进行检查并进行相互间相关性分析。比较慢性乙型肝炎患者治疗前后血清/肠道HBV DNA、菌群间比值及血白介素-17AF变化;对常规治疗组与微生态治疗组间治疗前后上述指标的变化进行比较。结果（一）1.66例慢性乙型肝炎患者治疗前血清来源和粪便来源HBV DNA拷贝数均高于检测下限值。粪便来源与血清来源HBV DNA拷贝数呈正相关（r=0.57）。HBe抗原阳性组粪便HBV DNA拷贝数明显高于e抗原阴性组（P<0.05）。粪便来源HBV DNA与碱性磷酸酶（r=-0.41）,总胆红素（r=-0.29）呈负相关。抗病毒治疗后血清HBV DNA阴转率与粪便HBV DNA阴转率无差异（P>0.05）,血清HBV DNA阴转组与粪便HBV DNA阴转组肝功能均明显好转,差异无显着性（P>0.05）。2.与健康志愿者相比,66例慢性乙型肝炎患者治疗前,肠杆菌科、肠球菌、梭菌属、白色念珠菌及拟杆菌菌属DNA拷贝数明显增加（P<0.05）,而双歧杆菌、乳酸杆菌、瘤胃球菌属及普雷沃氏菌属DNA拷贝数明显减少（P<0.05）。菌群间比值（大/双、大/乳、大/瘤、粪/双、粪/乳、粪/瘤、梭/双、梭/乳、梭/瘤、白/双、白/乳、白/瘤、拟/双、拟/乳、拟/瘤、大/普、粪/白、粪/拟、粪/普、梭/白、梭/拟、梭/普及白/普）明显增大（P<0.05）;菌群间比值（大/粪、大/梭及粪/梭）明显减小（P<0.05）;菌群间比值（大/白、大/拟、粪/拟、白/拟、双/乳、乳/瘤及双/瘤）无明显变化（P>0.05）。3.肠道HBV DNA与肠球菌、粪/白、粪/普及粪/瘤呈正相关,与大/粪呈负相关;血清HBV DNA与粪/乳、白/乳及普/乳比值呈正相关,与乳酸杆菌及乳/双呈负相关。4.66例慢性乙型肝炎患者治疗前,肠道菌群及菌群间比值变化与肝功能变化间存在相关性:总胆红素与肠杆菌科、白色念珠菌、瘤胃球菌属、大/双、大/梭、大/拟、粪/双、梭/双、白/双及白/普呈正相关,与双歧杆菌、梭/瘤、拟/瘤及普/瘤呈负相关。其中,总胆红素与大/普及瘤/双呈正相关正相关,相关性最强（r=0.42）,与拟/瘤及普/瘤呈负相关,相关性最强（r=-0.34）。白蛋白与大/瘤、乳/双、白/瘤及普/瘤呈正相关,与白色念珠菌、瘤胃球菌属及拟/双呈负相关。其中,白蛋白与梭/瘤呈正相关,相关性最强（r=0.40）,与瘤/双间比值呈负相关,相关性最强（r=-0.39）。谷丙转氨酶与肠杆菌科、乳梭杆菌、梭菌属、大/白、大/拟,大/普、粪/拟、粪/普、乳/双、梭/普、梭/拟、白/拟及白/普呈正相关,与白/乳、拟/乳、普/乳、梭/瘤、白/瘤及拟/瘤呈负相关。其中,谷丙转氨酶与瘤胃球菌属呈正相关,相关性最强（r=0.47）,与普/瘤呈负相关,相关性最强（r=-0.43）。谷草转氨酶与肠球菌、白色念珠菌、大/双、粪/普、乳/双、梭/双、白/双、瘤/双呈正相关,与双歧杆菌、拟杆菌属、普沃氏菌属、拟/乳、普/乳、拟/普、拟/瘤及普/瘤呈负相关。其中,谷草转氨酶与大/拟、大/普、粪/双、粪/拟、乳/双、梭/拟、梭/普、白/拟及白/普均呈正相关,相关性最强（r>0.6）,与拟/乳及拟/瘤均呈负相关,相关性最强（r=-0.56）。碱性磷酸酶与大/双、大/拟、粪/拟、梭/双、白/双、普/双、瘤/双、梭/普及白/拟呈正相关,与拟杆菌属及拟/瘤呈负相关。其中,碱性磷酸酶与粪/双呈正相关,相关性最强（r=0.51）,与双歧杆菌呈负相关,相关性最强（r=-0.45）。谷氨酰转肽酶与肠球菌、乳酸杆菌、粪/双及乳/双呈正相关,与白/乳及普/乳呈负相关。其中,谷氨酰转肽酶与梭菌属呈正相关,相关性最强（r=0.37）,与拟/乳呈负相关,相关性最强（r=-0.28）。5.与健康志愿者相比,66例慢性乙型肝炎患者治疗前血清IL-17AF含量均明显升高（P<0.01）;治疗后血清IL-17AF含量均明显降低（P<0.01）。6.治疗前,肠道HBV DNA与IL-17B、IL-17D及IL-17E变化正相关;血清HBV DNA与IL-17AF变化间均无相关性。7.治疗前,IL-17A与粪/白及粪/瘤呈正相关,IL-17B与瘤/乳呈负相关,IL-17C与大/粪、拟/乳及普/乳呈负相关,IL-1D与粪/双呈正相关。8.治疗前,IL-AF与IL-1β、IL-6及CXCL-13变化呈正相关。9.治疗前,IL-AF与总胆红素变化呈负相关;IL-17B及IL-17E与白蛋白变化呈正相关,IL-17C与IL-17E与谷胺酰转肽酶均呈负相关。结果（二）1.微生态治疗组治疗后血清HBV DNA阴转率为33.30%,常规治疗组治疗后血清HBV DNA阴转率为24.24%,两者间比较差异无统计学意义（P>0.05）;微生态制剂治疗组治疗后粪便HBV DNA阴转率为15.15%,明显低于常规治疗组（30.30%）,但两者间比较差异无统计学意义（P>0.05）。2.与常规治疗组相比,微生态治疗组患者肠杆菌科、双歧杆菌DNA拷贝数治疗后减少更明显（P<0.01）,肠球菌治疗后增加更明显（P<0.05）。大/粪、大/梭、大/白、大/拟、大/普及大/瘤比值治疗后更减小（P<0.05）,粪/梭、粪/白、粪/双、粪/乳、粪/瘤、梭/双、白/双及普/双比值治疗后更增大（P<0.05）。3.与常规治疗组比较,微生态治疗组治疗后血清IL-17A、IL-17C、IL-17D及IL-17F下降更明显（P<0.01）。4.与常规治疗组相比,微生态治疗组患者谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶治疗后改善更明显（P<0.05）,但总胆红素治疗后上升更明显（P<0.05）。结论1.检测慢性乙型肝炎患者粪便来源HBV DNA与血清来源HBV DNA临床意义不完全相同。3.慢性乙型肝炎患者存在IL-17家族各成员表达,多种肠道菌群间动态平衡破坏,两者具有一定的相关性,它们与肝脏损伤存在相关性。8.微生态制剂治疗能促进肝脏细胞损伤的修复。其机制可能与改善肠道菌群间比值紊乱程度,下调IL-17家族成员表达有关。但可能引起新的肠道菌群间动态平衡的破坏及肝脏损害。
二、不同方法抽提血清HBV DNA得率的比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同方法抽提血清HBV DNA得率的比较（论文提纲范文）
（1）实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 样本收集 |
| 1.1.3 试剂及仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 SAT检测 |
| 1.2.2 qRT-PCR检测 |
| 1.2.3 对2种检测方法的评价 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 入组患者的一般情况 |
| 2.2 2种方法在HBV DNA≥100IU/mL样本的比较 |
| 2.4 2种方法在非HBV感染样本的比较 |
| 3 讨论 |
（2）用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 用于检测培养上清中 HBV DNA 和 RNA 的双重定量PCR 体系的建立 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 用拷贝数相减法检测 hep G2.2.15 细胞内和培养上清中的 HBV DNA 和 RNA |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 双重定量 PCR 检测 HBV DNA 和 RNA 的方法的改良 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 工作小结 |
| （一）主要研究内容 |
| （二）下一步需要解决的问题 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HBV RNA 的检测方法和临床意义研究进展 |
| 一、病毒复制周期中的血清HBV RNA |
| 二、血清HBV RNA的种类和检测方法 |
| 三、血清HBV RNA与其他HBV标记物的相关性 |
| 四、血清HBV RNA的临床意义 |
| 五、血清HBV RNA的研究展望 |
| 六、总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（3）乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 HBV-pgRNA通过与IGF2BP3相互调控,促进HBV相关HCC的发生和进展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 六、参考文献 |
| 第二部分 IFN-α-2a通过增加pgRNA的m6A修饰降低其稳定性,阻断pg RNA-IGF2BP3 信号轴,抑制HCC的进展 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 六、参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述 乙型肝炎病毒前基因组 RNA 在乙肝相关疾病发病机制及临床应用中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（4）新型血清学标志在HBV感染者及HBV合并HIV感染者中的检测价值（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 对象和方法 |
| 1.研究对象 |
| 2.研究方法 |
| 2.1 人口学特征 |
| 2.2 实验室检查指标 |
| 2.3 主要实验试剂 |
| 2.4 主要实验仪器及耗材 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.6 统计学方法 |
| 结果 |
| 1.HBV组及HIV-HBV共感染组一般资料与生化学、病毒学检查比较 |
| 2.HBV组 HBcrAg、HBV-RNA与其他病毒学指标的相关性 |
| 3.HIV-HBV共感染组HBcrAg、HBV-RNA与其他病毒学指标的相关性 |
| 4.HBV组 HBe Ag(+)患者中HBcrAg、HBV-RNA与其他病毒学指标的相关性 |
| 5.HBV组 HBe Ag(-)患者中HBcrAg、HBV-RNA与其他病毒学指标的相关性 |
| 6.HIV-HBV共感染组HBe Ag(+)患者中HBcrAg、HBV-RNA与其他病毒学指标的相关性 |
| 7.HIV-HBV共感染组HBe Ag(-)患者中HBcrAg、HBV-RNA与其他病毒学指标的相关性 |
| 9.HBV-HIV共感染组CD4≥250/mm3患者中HBcrAg、HBV-RNA与其他病毒学指标的相关性 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 HBV新型血清学标志物 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）基于肝脏自然杀伤细胞与肝星状细胞的关系探讨扶正化瘀方联合恩替卡韦有效逆转乙肝肝硬化的免疫调节机制（论文提纲范文）
| 主要缩略语 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 肝脏自然杀伤细胞在乙肝肝硬化及肝癌组织中的表型变化特点 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 分组 |
| 2 观察指标 |
| 2.1 实验室检查 |
| 2.2 肝组织病理检查 |
| 2.3 肝内NK细胞亚型及激活型受体检测 |
| 3 材料 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要仪器设备 |
| 4 方法 |
| 4.1 组织样本的处理 |
| 4.2 肝组织病理染色 |
| 4.3 肝内NK细胞亚型及表面激活型受体检测 |
| 4.4 石蜡切片免疫组化双重染色 |
| 4.5 统计分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 基本资料 |
| 5.2 肝组织病理学观察 |
| 5.3 肝内NK细胞亚型及表面激活型受体的表达特点 |
| 5.4 肝内NK细胞数量、亚型与临床基本资料的相关性分析 |
| 5.5 肝内NK细胞表面激活型受体与临床基本资料的相关性分析 |
| 5.6 肝内NK细胞表面激活型受体NKG2D的表达与纤维化面积相关性分析 |
| 5.7 肝组织免疫组化双重染色观察肝内NK细胞与活化肝星状细胞的关系 |
| 6 分析与讨论 |
| 第二部分 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝脏自然杀伤细胞的免疫调控作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验分组、造模及药物干预 |
| 2.2 样品的采集与处理 |
| 2.3 血清病毒学检测 |
| 2.4 血清肝功能检测 |
| 2.5 肝组织病理染色 |
| 2.6 肝组织羟脯氨酸含量测定 |
| 2.7 石蜡切片免疫组化染色 |
| 2.8 Western Blot蛋白免疫印迹杂交 |
| 2.9 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 2.10 肝组织免疫荧光 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠体重及脏器指数的影响 |
| 3.2 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠病毒学指标的影响 |
| 3.3 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠血清肝功能的影响 |
| 3.4 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织炎症病理的影响 |
| 3.5 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织胶原沉积的影响 |
| 3.6 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织羟脯氨酸含量的影响 |
| 3.7 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织α-SMA及I型胶原表达的影响 |
| 3.8 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝内淋巴细胞分群的影响 |
| 3.9 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝内NK细胞表面激活型受体NKG2D表达的影响 |
| 3.10 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织RAE-1和Desmin表达的影响 |
| 3.11 扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织RAE-1和α-SMA表达的影响 |
| 4 分析与讨论 |
| 第三部分 体内清除自然杀伤细胞对扶正化瘀方联合恩替卡韦抗乙肝背景小鼠肝纤维化药效的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 主要试剂及仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 实验分组、造模及药物干预 |
| 2.2 样品的采集与处理 |
| 2.3 血清病毒学及肝功能生化检测 |
| 2.4 肝组织病理染色 |
| 2.5 肝组织羟脯氨酸含量测定 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠体重及脏器指数的影响 |
| 3.2 扶正化瘀方联合恩替卡韦对Anti-ASGM1清除乙肝背景肝纤维化小鼠肝内NK细胞的拮抗作用 |
| 3.3 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠血清病毒学指标的影响 |
| 3.4 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠血清肝功能的影响 |
| 3.5 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织炎症病理的影响 |
| 3.6 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织胶原沉积的影响 |
| 3.7 体内清除自然杀伤细胞后扶正化瘀方联合恩替卡韦对乙肝背景肝纤维化小鼠肝组织羟脯氨酸含量的影响 |
| 3.8 Anti-ASGM1清除乙肝背景肝纤维化小鼠肝内NK细胞后肝内主要淋巴细胞亚群的变化及扶正化瘀方联合恩替卡韦的干预作用 |
| 4 分析与讨论 |
| 第四部分 扶正化瘀方体外调节自然杀伤细胞功能的抗肝纤维化作用机制 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 细胞复苏、培养与冻存 |
| 2.2 药物配制 |
| 2.3 药物对细胞的毒性测定 |
| 2.4 Annexin V/7-AAD复染法检测细胞凋亡 |
| 2.5 荧光定量PCR检测mRNA表达 |
| 2.6 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 2.7 ELISA检测细胞因子分泌水平 |
| 2.8 NK92与CFSE-K562细胞共培养杀伤体系的建立及药物评价 |
| 2.9 药物预孵育的NK92与LX-2共培养 |
| 2.10 细胞免疫荧光检测 |
| 2.11 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 扶正化瘀方对NK92细胞株和LX-2细胞株的毒性测定 |
| 3.2 扶正化瘀方对NK92细胞株凋亡的影响 |
| 3.3 扶正化瘀方对NK92细胞表面激活型受体表达的影响 |
| 3.4 扶正化瘀方对NK92细胞分泌IFN-γ和Granzyme B水平的影响 |
| 3.5 扶正化瘀方对NK92细胞株杀伤K562功能的影响 |
| 3.6 扶正化瘀方预孵育的NK92与LX-2共培养后NK92细胞表面激活型受体NKG2D的表达变化 |
| 3.7 扶正化瘀方预孵育的NK92与LX-2共培养后LX-2细胞表面配体RAE-1的表达变化 |
| 3.8 扶正化瘀方预孵育的NK92与LX-2共培养后LX-2细胞活化情况 |
| 4 分析与讨论 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 :文献综述 基于肝脏免疫微环境探讨中西医结合有效逆转乙肝肝纤维化的目标人群特征和作用机制 |
| 参考文献 |
| 附录2 :在校期间发表学术论文 |
| 在校期间发表的学术论文1(首页) |
| 在校期间发表的学术论文2(首页) |
| 在校期间发表的学术论文3(首页) |
| 在校期间发表的学术论文4(首页) |
| 在校期间发表的学术论文5(摘要) |
| 在校期间发表的学术论文6(Abstract) |
| 在校期间发表的学术论文7(Abstract) |
| 附录3 :参加学术会议及获奖情况 |
（6）LSD1在乙肝相关性肾炎肾小管间质炎症中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词及中英文对照表 |
| 绪论 |
| 第一部分 LSD1在乙肝相关性肾炎患者肾组织中的表达及其与肾间质炎症的关系 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 炎症标志物在对照组和HBV-GN组肾组织中的表达 |
| 3.2 LSD1 在对照组和HBV-GN组肾组织中的表达 |
| 3.3 LSD1 与肾间质炎症在HBV-GN组肾组织中的关系 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第二部分 LSD1 在肾小管上皮细胞中的表达及其对HBV诱导的肾小管上皮细胞炎症因子分泌的影响 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 HBV感染HK-2 细胞模型的构建 |
| 3.2 HBV诱导HK-2细胞炎症因子分泌增加及LSD1表达上调 |
| 3.3 LSD1对HBV诱导HK-2细胞炎症因子分泌的影响 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 第三部分 LSD1 通过调节TLR4 通路的活化调控HBV诱导的肾小管上皮细胞炎症因子分泌 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 LSD1 沉默后TLR4 mRNA表达降低(RNA-seq) |
| 3.2 LSD1直接调节TLR4的表达 |
| 3.3 TLR4对HBV诱导HK-2细胞炎症因子分泌的影响 |
| 3.4 LSD1 通过直接调节TLR4 的表达调控HBV诱导的肾小管上皮细胞炎症因子分泌 |
| 3.5 LSD1 通过直接调节TLR4 的表达调控NF-κB和 MAPK信号通路活化 |
| 3.6 TLR4 相关的NF-κB和 JNK信号通路调控HBV诱导的肾小管上皮细胞炎症因子分泌 |
| 4.讨论 |
| 5.小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间已发表或录用的论文 |
（7）应用高灵敏方法评估现行HBV母婴阻断方案研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、现行HBV母婴阻断方案实施后子代乙肝病毒标志物研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 对象 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.3 统计方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 HBsAg阳性母亲所生孩子基本情况 |
| 1.2.2 HBV母婴阻断后孩子乙肝病毒标志物表达变化情况分析 |
| 1.2.3 孩子出生2 天肝功能与性别、母亲HBV DNA、母亲孕期应用LdT的关系 |
| 1.2.4 孩子肾功能与性别、出生2 天肝功能、母亲HBV DNA及其孕期应用LdT的关系 |
| 1.2.5 HBsAg阳性母亲所生孩子性别与乙肝病毒标志物阳性率情况比较 |
| 1.2.6 HBsAg阳性母亲孕期抗病毒治疗与乙肝病毒标志物阳性率变化情况比较 |
| 1.2.7 HBsAg阳性母亲分娩前HBV DNA水平与孩子乙肝病毒志物阳性率变化情况比较 |
| 1.2.8 HBsAg阳性母亲分娩前HBeAg的状态与孩子乙肝病毒志物阳性率变化情况比较 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、现行HBV母婴阻断方案疗效新评估 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 对象 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.3 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 13例 HBsAg 阳性母亲所生孩子基本情况及肝肾功能随访情况 |
| 2.2.2 13 例HBsAg阳性母亲HBV情况和孩子随访及干预情况 |
| 2.2.3 HBsAg阳性母亲所生孩子2 月时乙型肝炎病毒情况 |
| 2.2.4 HBsAg阳性母亲所生孩子7 月时肾功能、乙型肝炎病毒情况 |
| 2.2.5 HBsAg阳性母亲所生孩子12 月时肾功能、乙型肝炎病毒情况 |
| 2.2.6 HBsAg阳性母亲所生孩子24 月时肾功能、乙型肝炎病毒情况 |
| 2.2.7 HBsAg阳性母亲、脐带血及所生孩子血液标本nested PCR结果汇总 |
| 2.2.8 孩子发生OBI的相关因素分析 |
| 2.2.9 补种HepG和 HBIG与 OBI发生的关系 |
| 2.2.10 HBsAg阳性母亲所生孩子行nestedPCR后 HBVDNA阳性率分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 HBV母婴传播导致隐匿性HBV感染的流行病学 |
| 2.3.2 HBV母婴传播导致隐匿性HBV感染的危险因素及应对策略探讨 |
| 2.3.3 检测HBV母婴传播导致隐匿性HBV感染的新方法 |
| 2.3.4 不同血液标本对OBI诊断敏感性比较 |
| 2.3.5 补种HepG和 HBIG与 OBI发生的关系 |
| 2.4 小结 |
| 三、实施HBV母婴阻断后HBsAg阳性母亲随访研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 对象 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.1.3 统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 HBsAg阳性母亲基本情况及分娩前后肝功能变化 |
| 3.2.2 HBsAg阳性母亲家族史及分娩前后肝功能变化分组比较 |
| 3.2.3 产后HBsAg阳性母亲发生肝炎发作相关相关性分析 |
| 3.2.4 产后HBsAg阳性母亲HBV DNA反弹情况分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）慢性乙型肝炎患者血清与粪便HBV DNA水平对比研究（论文提纲范文）
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 检测指标 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料 |
| 2.2 不同临床分度CHB患者HBV DNA水平的比较 |
| 3 讨论 |
（9）建立实时荧光定量PCR检测HBV感染者血清pgRNA水平及其临床意义（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景 |
| 第一部分 建立实时荧光定量PCR检测HBV感染者血清pgRNA水平及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 不同临床结局HBV感染者血清HBVpgRNA水平与HBV传统血清学标志物的相关性 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）慢性乙型肝炎患者肠道乙肝病毒DNA、菌群间比值、血清白细胞介素-17A～F的变化及肠道微生态制剂治疗的疗效研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 肠道菌群间比值的简称及算式 |
| Abbreviation and Calculation of the ratio between the intestinal flora |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 慢性乙型肝炎患者肠道HBV DNA、菌群间比值及血清IL-17A～F变化 |
| 一、粪便HBV DNA的定量检测及与血清HBV DNA、肝功能间相关性研究 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 研究对象、来源及入选标准 |
| 2.2 主要试剂及仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 3.结果 |
| 3.1 血清及粪便来源HBV DNA检测结果 |
| 3.2 血清HBe抗原阳性患者与HBe抗原阴性患者HBV DNA变化比较 |
| 3.3 慢性乙型肝炎患者肝功能与HBV DNA间相关性分析结果 |
| 3.4 抗病毒治疗13±1后肝功能在血清/粪便HBV DNA阴转组间变化比较 |
| 3.5 血清HBV DNA阴转组与粪便HBV DNA阴转组治疗前后肝功能变化间比较 |
| 3.6 抗病毒治疗后血清及粪便HBV DNA阴转率比较 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 二、慢性乙型肝炎患者肠道菌群比值变化及与血/粪便HBV DNA、肝功能间相关性分析 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 研究对象、来源及入选标准 |
| 2.2 主要试剂与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 肠道菌群间比值计算 |
| 2.5 血清及粪便HBV DNA检测 |
| 2.6 肝功能检测 |
| 2.7 统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 九种肠道菌群PCR产物电泳结果 |
| 3.2 九种肠道菌群溶解曲线、标准曲线及标准曲线方程结果 |
| 3.3 健康志愿者与慢性乙型肝炎患者肠道菌群比值比较 |
| 3.4 肠道菌群比值与血清/粪便HBV DNA间相关性分析结果 |
| 3.5 肠道菌群比值与肝功能指标间相关性分析结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 三、慢性乙型肝炎患者白细胞介素-17A～F的表达及与HBV DNA、肠道菌群、肝功能间关系 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 标本采集 |
| 2.3 主要试剂与仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.5 统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 细胞因子标准曲线的绘制和分析 |
| 3.2 慢性乙型肝炎患者与健康志愿者间IL-17A～F变化比较结果 |
| 3.3 66例慢性乙型肝炎患者自身治疗前后IL-17A～F变化结果 |
| 3.4 血清IL-A～F与IL-1β，IL-6，CXCL-13 间相关性分析结果 |
| 3.5 IL-17A～F与肝功能间相关性分析结果 |
| 3.6 IL-17A～F与血清HBV DNA、粪便HBV DNA相关性分析结果 |
| 3.7 IL-17A～F与肠道菌群及比值间相关性分析结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 肠道微生态制剂治疗对慢性乙型肝炎肠道HBV DNA、菌群间比值、血清IL-17A～F及肝功能变化的影响 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 研究对象、来源及入选标准 |
| 2.2 主要试剂及仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 研究方案 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3.结果 |
| 3.1 微生态治疗组治疗后HBV DNA阴转率、肠道菌群间比值、IL-17 及肝功能变化 |
| 3.2 常规治疗组治疗前后HBV DNA阴转率，肠道菌群间比值、细胞因子及肝功能变化比较 |
| 3.3 微生态治疗组与常规治疗组间治疗疗效比较 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 肠道微生态与慢性肝病的研究进展 |
| 参考文献 |
四、不同方法抽提血清HBV DNA得率的比较（论文参考文献）
- [1]实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价[J]. 黄晨璐,许伟,胡乾坤,张小楠,李强,黄玉仙,陈良. 微生物与感染, 2020(03)
- [2]用探针法双重定量PCR同时检测乙型肝炎病毒前基因组RNA和DNA[D]. 徐博文. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [3]乙肝病毒前基因组RNA在肝细胞癌发生和进展中的作用及机制研究[D]. 丁文斌. 中国人民解放军海军军医大学, 2020
- [4]新型血清学标志在HBV感染者及HBV合并HIV感染者中的检测价值[D]. 吕菲南. 天津医科大学, 2020(06)
- [5]基于肝脏自然杀伤细胞与肝星状细胞的关系探讨扶正化瘀方联合恩替卡韦有效逆转乙肝肝硬化的免疫调节机制[D]. 孙鑫. 上海中医药大学, 2019(02)
- [6]LSD1在乙肝相关性肾炎肾小管间质炎症中的作用研究[D]. 杨以通. 上海交通大学, 2019(06)
- [7]应用高灵敏方法评估现行HBV母婴阻断方案研究[D]. 徐亮. 天津医科大学, 2019(05)
- [8]慢性乙型肝炎患者血清与粪便HBV DNA水平对比研究[J]. 王明,张抒,李明,文君,郑振江. 实用肝脏病杂志, 2019(02)
- [9]建立实时荧光定量PCR检测HBV感染者血清pgRNA水平及其临床意义[D]. 叶爱珠. 福建医科大学, 2018(09)
- [10]慢性乙型肝炎患者肠道乙肝病毒DNA、菌群间比值、血清白细胞介素-17A～F的变化及肠道微生态制剂治疗的疗效研究[D]. 郑吉顺. 安徽医科大学, 2016(01)
标签：hbv-dna论文; 乙肝表面抗原阳性论文; 乙肝阴性论文; 肝癌症状论文; dna论文;