一、Identification of differentially expressed genes of primary spermatocyte against round spermatid isolated from human testis using the laser capture microdissection technique（论文文献综述）
李欣[1]（2021）在《基于比较转录组学方法研究牛精子变形机制》文中认为精子变形过程通过影响精子质量,进而影响到种公畜的繁殖机能,劣质精液甚至可能诱发雄性不育。当前,由于繁殖效率已成为产业关注的焦点,并且,男性不育社会问题日益突出,作为精子发生和成熟阶段的变形过程,逐渐成为科研的焦点。该过程中任何功能基因表达异常,都会影响精子形态、结构,甚至危及精子功能,导致雄性不育。因此,深入揭示精子变形调控机制,挖掘重要功能基因,已成为雄性繁殖障碍成因探索和防控的焦点。我们对奶牛圆形精细胞、长形精细胞和附睾尾精子进行了转录组分析,为找到对精子变形有重要作用的差异表达基因（Different expression genes,DEGs）,引入了遗传背景较为清晰模式动物小鼠同阶段转录组测序数据作为参考,采用物种间同源比较分析方法,获取了小鼠和牛同源且趋势相同表达基因。具体的研究方法为:首先,本研究对牛和小鼠同时期的RNA-seq数据进行生物信息学分析,计算出了该过程中所涉及基因的表达量并筛选出了DEGs;并对牛RNA-seq数据进行了RT-q PCR验证以及与小鼠数据的PCA聚类分析,表明测序数据准确可靠且可重复。差异分析发现,精子变形过程中,上调基因逐渐减少,下调基因逐渐增加。但是,精子均有上调表达基因,表明该过程中,虽然染色体固缩,转录逐渐降低,但并未完全终止。对筛选出的牛精子变形期间DEGs进行Gene ontology（GO）和Kyoto Ency clopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析。同时,对牛和小鼠变形期DEGs进行PPI分析,获得了RHOD、IFNG、STAT5A、CXCL16和F2RL1等43个核心调控蛋白,这些蛋白均与5个以上蛋白直接相互作用。核心蛋白表达一旦改变,将会对整个网络正常生物功能的发挥产生重要影响。进一步对该PPI网络进行MCODE（Molecular Complex Detection）分析,共获得了11个精子变形的核心调控网络。然后,本研究进行了奶牛精子变形期DEGs与小鼠同时期精子同源趋势比较,共获得578个同源同趋势差异基因。对这578个基因进行PPI分析,获得了由UBC、KAT5、HDAC1和PARP1为核心的调控精子泛素化、乙酰化、去乙酰化及糖基化的调控网络。其中,隶属于NAD+ADP-ribosyltransferase activity（GO:0003950）条目的ART3基因可能与PARP1作用相同,可能通过糖基化作用修复因鱼精蛋白替换组蛋白导致的DNA链断裂。为深入探究ART3在精子变形过程中的作用,在睾丸上进行了ART3免疫荧光定位,发现圆形和长形精细胞上的阳性信号均位于指向管腔的细胞膜上。因为长形精细胞头部朝向基底层,尾部朝向管腔,推测该蛋白与精子尾部形成有关。为进一步揭示ART3在圆形、长形精细胞和附睾尾精子中的生物学作用,我们通过免疫沉淀结合质谱分析,再根据ART3在精细胞膜表达的免疫荧光结果,筛选出了16个细胞膜定位蛋白,这些蛋白与ART3互作的可能性需进一步研究验证。最后,本研究向小鼠睾丸注射ART3抑制剂3-MBA,发现3-MBA降低了精子生成的数量和质量,并使精子畸形率显着上升,影响到了精子功能,其与头部有关的前向运动比率、与精子尾部有关的活力都显着下降。同时,以0.906 mg/m L剂量注射小鼠睾丸6 h后,注射鼠曲细精管内空泡逐渐增多增大,到第5 d时空泡化达最大;精细胞的排布变得散乱不规则,生精细胞逐渐减少。结合前期对ART3定位及生物信息学分析结果,推测ART3与精子的头部和尾部形成相关。这些结果为深入揭示精子变形期生命奥秘,提供了重要数据支撑。
张飞[2]（2021）在《长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析》文中指出睾丸发育、精子生成过程涉及生殖细胞、间质细胞和支持细胞在内的多种细胞协同作用,该过程受到极其复杂和严格的分子时空调控,人们对其理解仍十分有限。环状RNA作为一类新的长链非编码RNA存在于人和牛等动物的睾丸及精清中,可能参与调控睾丸发育及精子发生过程。然而,公猪睾丸组织发育成熟过程中环状RNA的表达谱及其潜在生物学功能尚不清楚。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是存在于RNA内部最常见的一类修饰,参与调控细胞分化、个体发育等多种生理病理进程,但关于m6A与睾丸发育、精子发生之间的关系目前仍知之甚少。因此,本文选取性成熟前后两个不同发育阶段的长白公猪睾丸组织,利用高通量测序技术和生物信息学等手段,揭示不同阶段睾丸中的环状RNA和m6A表达特征并比较分析其表达差异,预测和解析差异表达的环状RNA、m6A修饰在睾丸发育和精子发生事件中的潜在生物学功能,为增进了解环状RNA、m6A修饰参与公猪精子发生、睾丸发育调控等提供新的线索。本论文得到研究结果如下:本研究对未成年（30日龄,D30）和性成熟（210日龄,D210）长白公猪睾丸进行组织形态学观察。H&E染色结果显示,30日龄长白公猪睾丸曲细精管尚未发育完整,睾丸内未见明显管腔,处于性成熟前阶段;210日龄长白公猪睾丸体积显着增大,曲细精管发育完全,内含大量不同类型的生殖细胞并产生大量圆形精子及长形精子,已达到性成熟后阶段。使用去除核糖体RNA及线性RNA的总RNA-Seq来检测D30和D210长白公猪睾丸组织中环状RNA的表达谱。高通量测序显示睾丸组织中含有丰富的环状RNA,性成熟前后睾丸中分别鉴定出34521与31803个环状RNA。生物信息学分析发现这些环状RNA广泛分布于常染色体和性染色体上,长度主要位于100～10000 nt之间（58.97%）,主要来源于源头基因的外显子区域,大部分环状RNA由1-7个外显子形成（86.54%）,并且部分源头基因可以产生多个环状RNA。在公猪睾丸成熟过程中共发现来源于1526个源头基因的2326个差异表达的环状RNA,其中1003个D210公猪睾丸组织中上调,1323个下调。此外,差异表达的环状RNA源头基因GO功能分析显示这些环状RNA主要与精子发生、激素生物合成过程的正调控、生殖细胞发育、雄性减数分裂等生物过程有关。KEGG通路富集分析发现他们分别参与了干细胞多能性调节、紧密连接、粘附连接、cAMP等信号通路。因此,以上结果表明性成熟前后公猪睾丸表达大量的环状RNA,这些环状RNA呈现发育阶段特异性的动态表达模式,且主要与睾丸发育、精子发生等生物学过程密切相关。这些结果将有望为鉴定种公猪睾丸发育状态及筛选优秀种公猪提供一种潜在的分子标记物。同时为了研究睾丸发育成熟过程中m6A甲基化修饰的动态变化,本研究绘制了长白猪性成熟前后睾丸转录组范围信使RNA m6A甲基化图谱。本研究描述了m6A甲基化修饰在睾丸发育过程中的广泛分布模式,并分析了基因表达与m6A甲基化修饰的关系,同时广泛地鉴定了性成熟前后m6A甲基化修饰差异基因,这些基因可能与睾丸的生物学功能的密切相关。这些结果为确定睾丸中mRNA m6A甲基化的存在及其图谱提供了依据,并扩展了对m6A在哺乳动物器官发育和生长中作用的认识。
高源[3]（2021）在《安格斯牛睾丸组织非编码RNA鉴定及单细胞转录图谱绘制》文中提出安格斯牛是肉牛生产的主要品种之一,具有性成熟早、易产、初生重小、生长速度快、肉质好、适应力强等优点。安格斯牛作为肉质好的代表品种被大量引进用来改良地方牛品种,在优质高档牛肉的生产方面取得了显着成效。公牛是种牛群的重要组成部分,在肉牛群体遗传性能改良过程中发挥着重要作用。种公牛为肉牛的生产提供大量优质的精液,以便优良遗传性状得以稳定遗传,因此理想的繁殖性能对种公牛至关重要。睾丸是精子发生的重要器官,正常的睾丸发育是种公牛优良繁殖性能的基础,因此探究公牛睾丸发育及精子发生的遗传机理和分子调控机制,对选育高产优质种公牛具有重要意义。睾丸发育和精子生成依赖于转录、转录后水平相关基因精确的调控,而非编码RNA被证实在转录或转录后水平调控中扮演着极其重要的角色。因此,本研究选用安格斯牛为研究对象,在转录组水平进行ncRNA（lncRNA、miRNA、circRNA）的鉴定分析及功能验证,意在寻找安格斯牛性成熟过程中睾丸发育与精子生成相关的ncRNA,从而从ncRNA的角度解析牛睾丸发育的遗传基础。同时,借助单细胞转录组测序技术进行公牛睾丸发育的细胞图谱绘制和标记基因鉴定,为探索公牛精子生成、睾丸体细胞发育的分子调控及转录调节机制提供了基础数据。本研究的主要结果如下:（1）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸lncRNA进行测序分析,共鉴定出23,735个lncRNA;其中,540个lncRNA（P<0.05）和3,525个mRNA（P-adj<0.05）差异表达;GO和KEGG富集分析表明差异表达的lncRNA靶基因和mRNA大多富集在与精子发生相关的过程中富集;通过lncRNA-mRNA互作分析,构建了与睾丸发育相关的15个DE lncRNA和12个顺式作用靶基因的互作网络,其中lncRNA的靶基因（SPATA16、TCF21、ZPBP、PACRG、ATP8B3、COMP、ACE和OSBP2）与牛睾丸发育和性成熟有关。（2）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸miRNA进行测序分析,共鉴定出566个已知的miRNA,以及86个新miRNA;差异表达分析表明,性成熟期与初生期相比共有223个差异表达的miRNA（202个已知和21个新的miRNA）;相较于初生期组,性成熟期睾丸中有112个miRNA表达上调（92个已知的和20个新的miRNA）和111个表达下调的miRNA（110个已知的和20个新的miRNA）（P-adj<0.05,|log2fold-change|>1）;根据KEGG富集分析发现,差异表达的miRNA靶基因富集到与睾丸发育、精子生成相关的通路中。（3）通过对安格斯牛不同发育时期的睾丸circRNA进行测序分析,共鉴定出28,065个候选的circRNA,其中7,458个circRNA在初生期和性成熟期牛睾丸中共同存在;初生期和性成熟期牛睾丸中存在987个circRNAs差异表达（P<0.05）,以初生期为对照,性成熟期表达上调的有710个circRNAs,下调的有277个circRNAs。GO和KEGG功能富集分析发现差异circRNA的宿主基因显着富集在了36个GO项以及8条通路。（4）根据circRNA测序数据筛选出差异表达的circ SMC1B,并验证发现circ SMC1B在性成熟期高表达,且在牛雄性生殖干细胞中高表达。通过过表达circ SMC1B且利用CCK-8、Ed U、流式细胞、RT-q PCR等实验发现circ SMC1B促进牛m GSCs的增殖和凋亡;RNAhybrid软件预测及双荧光素酶报告实验证明circ SMC1B竞争性结合let-7i;通过CCK-8、Ed U、流式细胞、RT-q PCR等实验发现let-7i靶向HMGA1和NR6A1抑制牛m GSCs的增殖和凋亡;且发现circ SMC1B可竞争性结合let-7i调节靶基因HMGA1和NR6A1表达,促进m GSCs增殖凋亡。（5）利用scRNA-seq技术对性成熟前后牛睾丸细胞进行转录组测序,通过聚类分析将睾丸细胞分为12个类群,其中包括9种体细胞和3种生殖细胞;并鉴定出一些牛睾丸不同类群细胞的特异标记基因,如ARSE、CLEC12B、GAS1、KRT8、LOC101908015、HIGD1B、CCL21、ESX1、MEIOB、SPATA19等;通过聚类分析将睾丸生殖细胞分为13个类群,分别在其中鉴定了特异表达的基因,这为解释牛睾丸发育和精子生成的机制提供了理论依据。本研究通过RNA-seq和scRNA-seq对公牛睾丸组织编码基因和ncRNA表达进行综合分析,发现公牛睾丸组织中存在大量与睾丸发育和精子发生相关的差异表达ncRNA和mRNA,且鉴定出公牛睾丸组织中不同细胞类群的特异标记基因,这为丰富公牛睾丸发育和精子生成转录调节机制提供了宝贵资源,为利用分子辅助选育技术筛选优良种公牛,建立公牛良种繁育体系提供了可靠的理论指导和技术支撑。
于秀伟[4]（2021）在《通过单细胞测序定义奶山羊精子发生综合路线图》文中指出关中奶山羊是乳用型品种,其综合了西农萨能奶山羊和陕西关中地区的本地山羊的优点,其繁殖率高、乳用性能好。奶山羊作为畜牧业中重要的成分,但由于良种匮乏和繁殖率低的问题一直困扰着奶山羊业的快速健康发展,如何高效筛选优质种畜是一大难题,也是人们关注的问题之一。探究其精子发生过程以及准确定义奶山羊精原细胞特异性标记基因对于选育育种工作具有重要的指导意义。精子发生是一个复杂且持续的过程,由于这种特性,睾丸生精上皮中通常存在34波生精波,因此存在全部生精阶段的所有细胞。睾丸的这种异质性给研究精子发生的学者们造成了极大的困扰。单细胞测序技术（single cell RNA sequencing,scRNAseq）的出现和发展,使得哺乳动物组织或器官发生过程中细胞异质性的问题得到了解决。本研究通过单细胞测序技术,系统定义了奶山羊精子发生过程,鉴定了五种生精细胞。具体研究结果如下:（1）在单细胞分辨率水平,构建了关中奶山羊精子发生阶段和体细胞的单细胞转录图谱。通过tSNE聚类分析,成功确定了关中奶山羊精子发生过程中的精原细胞、早期精母细胞、晚期精母细胞、圆型精子细胞、延长型精子细胞。并描绘了这几类细胞的基因表达谱。基于不同细胞类型之间的差异分析,发现了一系列具有细胞类型特异性的标记分子。基于Monocle算法,成功构建了生殖细胞系、Sertoli细胞系、Leydig细胞和肌样细胞的拟时间分化轨迹,对精子发生过程进行了KEGG动态分析,阐述了关中奶山羊精子发生过程中拟时间基因表达变化过程。（2）筛选并鉴定了关中奶山羊精原细胞的特异性表达基因:TKTL1和AES,并在绵羊数据中验证了TKTL1和AES的表达。综上所述,本研究利用了scRNAseq测序技术,首次对关中奶山羊精子发生过程进行解析。从单细胞水平对主要细胞类型进行了鉴定,首次详细阐述了关中奶山羊精子发生过程中所涉及的不同类型细胞的基因表达谱,并阐明了精子发生过程中的基因表达变化情况,揭示了青春期关中奶山羊体细胞发育情况。该研究结果可丰富人们对关中奶山羊精子发生过程的认识,为关中奶山羊育种研究提供了有力的理论和技术支持。
罗正誉[5]（2020）在《减数分裂过程中三维基因组研究与多组学研究技术的开发》文中研究指明在过去的近二十年中,随着染色质高级结构研究方法的不断发展和突破,对不同物种以及不同生物学过程中染色质高级结构的研究一方面加深了我们对染色质高级结构及其形成机制和功能的了解,另一方面也促进了转录调控、细胞发育、疾病发生等其它领域的研究进展。嗜热四膜虫在一个细胞内具有两个发育来源相同,但最终在功能和基因组结构方面有较大差异的细胞核。通过Hi-C和HiChIP技术,我们对接合生殖过程中不同时期的嗜热四膜虫细胞进行了染色质高级结构的分析。我们发现嗜热四膜虫小核在减数分裂过程中具有特殊的染色质相互作用模式,其端粒和中心粒区域分别聚集在一起。此外,我们的研究发现嗜热四膜虫大核中没有类似哺乳动物细胞中 A/B compartments,topologically associating domains（TADs）,chromatin loops的染色质高级结构,但存在chromosome territories。嗜热四膜虫的小核中也没有类似哺乳动物细胞中A/B compartments和chromatin loops的染色质高级结构,但存在类似TADs的染色质高级结构。通过对小核中的TAD-like结构进行分析,我们发现其边界与染色质断裂位点高度重合。此外,我们的研究发现嗜热四膜虫小核中的一个TAD-like结构对应了大核中的一条染色体。我们的这部分研究工作首次描绘了嗜热四膜虫大、小核的染色质高级结构并提示小核中的TAD-like结构可能参与调控了接合生殖过程大核染色体的发育形成。小鼠的精子发生过程主要涉及到细胞分化、减数分裂、精子形成等一系列生物学过程。在通过Hi-C、ATAC-seq、ChIP-seq等对小鼠精子发生过程中的染色质高级结构,染色质开放状态以及相关蛋白在染色质上的结合情况进行分析后。我们发现,在小鼠精子发生过程中A/B compartments,TADs以及chromatin loops均发生了重组。其中A/B compartments始终存在,但其强度经历了由强到弱再到强的变化过程。TADs和chromatin loops则是经历了从有到无再到有的重组过程,二者在减数分裂的粗线期均基本丢失。进一步的研究结果表明粗线期TADs和chromatin loops的丢失不依赖于染色质开放状态,转录,以及CTCF/cohesin在染色质上结合状态的改变。此外,我们发现在转录失活的成熟精子中重建的chromatin loops与早期胚胎发育过程中表达的基因相关,提示染色质高级结构可能具有表观遗传的功能。在利用现有的技术方法探究不同物种和生物学过程中的染色质高级结构的同时,我们也进行了新技术和方法的开发。我们初步建立了可以在群体细胞水平进行开放染色质位点间染色质相互作用研究的HiATAC技术,该技术可以用于在全基因组水平捕获染色质开放区域间的相互作用,包括enhancer-promoter interactions。我们还初步建立了可以在单细胞水平同时捕获转录组与染色质开放位点的sci-AR技术。
李婷婷[6]（2019）在《水牛类精原干细胞体外培养及其相关调控关键基因挖掘的研究》文中认为水牛作为中国南方畜牧业中的重要家畜,不仅饲料转化率、乳制品的营养价值高,而且抗病力强,耐粗饲,具有较高的经济价值。然而水牛繁殖周期长,优质水牛数量少,水牛优良品种的培育成为了目前亟待解决的问题。精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）是哺乳动物进行基因修饰和种系保存的理想种子细胞,由于其在医学、畜牧学等领域的广阔应用前景,受到越来越多的关注。水牛SSCs体外培养相关研究目前仍处于初级阶段,水牛SSCs尚未实现体外长期培养,原因可能在于对水牛SSCs所处微环境缺乏足够的了解,对水牛SSCs自我更新和分化等相关机制还知之甚少。本研究对比了不同培养体系对幼年水牛SSC-like cells体外培养的影响,利用转录组学手段,以曲细精管和类精原干细胞（spermatogonial stem cell-like cells,SSC-like cells）为研究对象,在成年水牛和幼年水牛间开展了差异转录组学分析,筛选调控水牛SSC-like cells自我更新的关键信号通路,挖掘关键基因。本研究的结果能为水牛SSCs自我更新和增殖相关机制及体外长期培养系统等研究提供一定的参考。本研究的内容和结果如下:（1）比较了不同体系对水牛SSC-like cells体外培养的影响。结果显示:与成分不明的培养体系相比,成分明确的培养体系在体外维持幼年水牛SSC-like cells表型的时间更长（6 d vs 10 d）,且能更好地维持幼年水牛SSC-like cells的分子特性。（2）开展了对成年和幼年水牛曲细精管转录组研究。结果显示:以幼年（4月龄）水牛睾丸的曲细精管和成年（2-3岁）水牛睾丸的曲细精管为研究对象,共鉴定到了17299个基因,其中表达量具有显着性差异的基因一共有13174个（差异倍数>2;P<0.05）。相对于成年水牛曲细精管而言,幼年水牛曲细精管上调表达基因参与的生物进程主要是关于细胞膜表面蛋白质的表达、定位和识别,与未分化精原细胞表面抗原的形成、识别或者归巢等行为密切相关;而下调表达基因主要参与的生物进程则是与精子分化形成密切相关的过程。同时还富集到了8条在曲细精管中可能调控水牛SSCs自我更新的信号调控通路及4个关键基因:MYC、FZD10、ID4和CCL27。（3）利用单细胞转录组学技术,开展了成年和幼年水牛SSC-like cells差异转录组研究。结果显示:以幼年（4月龄）水牛SSC-like cells和成年（2-3岁）水牛SSC-like cells为研究对象,共鉴定到了21803个基因,其中表达量具有显着性差异的基因一共有1419个（差异倍数>2;P<0.05）。相对于成年水牛SSC-like cells而言,幼年水牛SSC-like cells上调表达基因参与的生物进程主要是脂质代谢、细胞表面受体信号通路、迁移过程等与干细胞自我更新状态的维持以及与干细胞的迁移相关的生物进程;而下调表达基因主要参与的生物进程则是细胞减数分裂周期、减数分裂细胞周期过程以及雄性配子的生成等与后期配子形成及分化相关的生物进程。共富集到了151条可能与水牛SSCs自我更新、增殖迁移等调控过程密切相关的信号通路以及与通路相应的关键基因。总之,本研究通过水牛曲细精管及SSC-like cells差异转录组学分析及水牛SSC-like cells体外培养初步研究,为进一步探究水牛SSC-like cells体外自我更新机制以及长期培养等研究提供了丰富的参考数据,也为探究水牛SSC-like cells成分明确的体外培养体系奠定了一定的研究基础。
徐荧[7]（2019）在《TGF-β3通过Lgl2调节大鼠血睾屏障及睾丸支持细胞乳酸分泌功能的机制研究》文中研究指明目的:在哺乳动物生精上皮中,睾丸支持细胞（Sertoli细胞）在精子发生过程中发挥着重要作用。相邻Sertoli细胞通过胞间连接形成血睾屏障（BTB）,将生精上皮分隔成与生精小管上皮基膜相近的基底小室和连接生精小管管腔的近腔小室,为精子的形成创造了一个免疫豁免的微环境。在生精上皮周期的VIII期,前细线期精母细胞从基底室向近腔室的迁移涉及精母细胞移行后方新BTB复合体的构建和移行前方原有BTB复合体的分解。由Sertoli细胞和生精细胞分泌的转化生长因子-β3（TGF-β3）已被证实能够通过多种途径引起BTB屏障功能损坏,促进生精细胞迁移,但其调控BTB屏障功能的分子机制尚未被完全阐明。本课题组前期通过基因芯片筛选出TGF-β3作用前后Sertoli细胞中差异表达的microRNAs（miRNAs）,其中miR-142-3p已被证实在多种细胞活动中参与了TGF-β介导的信号转导通路。我们前期通过生物信息学软件预测miR-142-3p能够特异性结合幼虫巨大致死性基因（Lgl）哺乳动物同源物Lgl2,推测miR-142-3p可能通过靶向Lgl2影响TGF-?3诱导的BTB屏障功能损伤。本研究第一部分旨在通过体内外BTB屏障功能研究进一步确定miR-142-3p对TGF-β3诱导的BTB屏障功能改变的调节作用,并探究其分子机制。乳酸是雄性生殖细胞的主要供能物质,在生精细胞能量代谢及精子发生过程中具有重要作用。Sertoli细胞除了通过形成BTB参与精子发生外,还是睾丸中乳酸的主要来源,其糖代谢模式类似肿瘤细胞中普遍存在的“Warburg效应”,能够通过高通量的有氧糖酵解分泌大量乳酸,为生精细胞提供能量及营养支持。TGF-?能够促进多种肿瘤和非肿瘤细胞的有氧糖酵解及乳酸分泌,但其作用机制尚不完全清楚。本研究第二部分在第一部分的研究基础上,探索了TGF-?3对Sertoli细胞糖代谢及乳酸分泌功能的调控作用,并探究其分子机制。方法:1、采用激光捕获显微切割（LCM）收集大鼠生精上皮周期不同阶段的生精小管外周细胞层,采用实时荧光定量PCR（qPCR）和免疫印迹检测TGF-?3、miR-142-3p、Lgl2的表达水平。2、体外培养大鼠原代Sertoli细胞,使用miRNA mimic过表达miR-142-3p后,使用重组人TGF-?3处理细胞24h。于不同时间点采用跨上皮电阻测定和荧光素钠通透率测定检测Sertoli细胞通透性;采用免疫沉淀和免疫印迹检测Cdc42、Cdc42-GTP、occludin、TGF-?3 I型受体的蛋白表达水平;采用免疫荧光检测occludin的分布。3、大鼠睾丸内注射agomiRNA过表达miR-142-3p后,注射重组人TGF-?3。于不同时间点采用生物素通透实验检测BTB通透性;采用qPCR检测miR-142-3p表达水平;采用免疫印迹检测occludin蛋白表达水平。4、在Lgl2基因中miR-142-3p的预测结合位点上构建突变序列,采用荧光素酶报告基因实验验证miR-142-3p对Lgl2的靶向结合作用。在大鼠原代Sertoli细胞中增加或抑制miR-142-3p表达后,分别采用免疫印迹和qPCR检测Lgl2的蛋白和mRNA表达水平。5、体外培养大鼠原代Sertoli细胞,使用miRNA mimic过表达miR-142-3p后,使用重组人TGF-?3处理细胞24h,采用qPCR和免疫印迹检测Lgl2表达水平。6、体外培养大鼠原代Sertoli细胞,使用siRNA沉默Lgl2后,使用重组人TGF-?3处理细胞24 h。于不同时间点采用跨上皮电阻测定和荧光素钠通透率测定检测Sertoli细胞通透性;采用免疫沉淀和免疫印迹检测Cdc42、Cdc42-GTP、occludin、Lgl2水平;采用免疫荧光检测occludin的分布改变。7、体外培养大鼠原代Sertoli细胞和TM4小鼠Sertoli细胞系,使用不同浓度重组人TGF-?3处理细胞6-24 h。检测细胞乳酸分泌量、葡萄糖消耗量、乳酸脱氢酶（LDH）活性、谷氨酰胺（Gln）消耗量、谷氨酰胺酶（Gls）活性及线粒体活性;采用免疫印迹检测细胞糖代谢和主要信号通路相关蛋白的表达改变。8、体外培养大鼠原代Sertoli细胞和TM4细胞,使用siRNA沉默Lgl2后,使用重组人TGF-?3处理细胞24 h。检测细胞乳酸分泌量、葡萄糖消耗量、LDH活性、Gln消耗量、Gls活性及线粒体活性;采用免疫印迹检测细胞糖代谢和主要信号通路相关蛋白的表达改变。9、体外培养大鼠原代Sertoli细胞和TM4细胞,使用siRNA沉默Lgl2后,使用Notch信号通路抑制剂DAPT处理细胞48 h。检测细胞乳酸分泌量、葡萄糖消耗量、LDH活性及线粒体活性;采用免疫印迹检测细胞糖代谢和Notch信号通路相关蛋白的表达改变;并于不同时间点采用跨上皮电阻测定检测大鼠原代Sertoli细胞的通透性。10、采用免疫组化观察Jagged1在大鼠生精上皮周期不同阶段的表达水平,并采用LCM收集大鼠生精上皮周期不同阶段的生精小管外周细胞层,采用qPCR检测Jagged1 mRNA的表达水平。11、大鼠睾丸内每日注射重组大鼠Jagged1,连续注射三天,在注射完成后的第3、5、10、20天分别采用HE染色观察精子发生情况。结果:1、在生精上皮周期各阶段中TGF-β3与miR-142-3p均具有完全相反的表达趋势,其中在VII-VIII期TGF-β3表达水平达到最高,同时期miR-142-3p表达水平降至最低。Lgl2蛋白表达水平在VIII期后出现明显下降,其mRNA表达水平随后在IV-IV期显着降低。2、miR-142-3p过表达能够显着抑制TGF-β3诱导的Sertoli细胞屏障功能减退、Cdc42活性升高和occludin表达降低。3、miR-142-3p过表达能够显着抑制TGF-β3诱导的大鼠睾丸内BTB屏障功能减退和occludin表达降低。4、miR-142-3p能够靶向结合Lgl2的3’UTR,并在翻译水平抑制Lgl2的蛋白表达。5、TGF-β3处理能够显着增加Sertoli细胞中Lgl2蛋白的表达水平,miR-142-3p能够抑制TGF-β3诱导的Lgl2蛋白表达升高。6、沉默Lgl2能够部分拮抗TGF-β3诱导的Sertoli细胞屏障功能减退及occludin表达降低,但对Cdc42表达及活性均无明显影响。7、TGF-β3处理能够抑制Sertoli细胞线粒体活性,促进Sertoli细胞糖酵解、Gln分解代谢及乳酸分泌,并能够在Sertoli细胞中激活MAPK信号通路,抑制Akt和Notch信号通路。8、在Sertoli细胞中沉默Lgl2能够拮抗TGF-β3对线粒体和Notch信号通路的抑制作用以及TGF-β3对糖酵解和乳酸分泌的促进作用,但不改变TGF-β3对Gln分解代谢及Akt、MAPK信号通路的影响。9、在Sertoli细胞中抑制Notch信号通路能够拮抗Lgl2沉默引起的线粒体活性增强、糖酵解减弱和乳酸分泌减少,但不影响Sertoli细胞通透性。10、Jagged1在大鼠生精上皮周期各阶段均表现出与TGF-?3相反的表达趋势。11、重组Jagged1介导的Notch信号通路活化引发可逆性大鼠精子发生障碍。结论:1、miR-142-3p能够通过靶向Lgl2抑制TGF-β3诱导的BTB屏障功能损伤。2、TGF-?3能够通过上调Lgl2的表达抑制Notch信号通路活性,从而促进Sertoli细胞的有氧糖酵解及乳酸分泌。
朱婉婉[8]（2019）在《牛精子发生过程中甲基化分析及干细胞向精子诱导分化的研究》文中进行了进一步梳理研究牛精子发生过程中的DNA甲基化,寻找与精子发生相关的基因,结合干细胞的体外培养与诱导,建立体外诱导干细胞分化形成功能性生殖细胞的完整体系,从而推进畜禽遗传育种、品种改良以及转基因品种的培育。精子发生包括有丝分裂、减数分裂和精子形成三个阶段,该过程中DNA甲基化起重要作用。DNA甲基化的正常表达调控精子的正确发生,而其异常表达则造成精子功能的异常。本研究通过激光显微切割技术获取牛精子发生过程中四种不同类型的细胞,研究精子发生过程中DNA甲基化的变化,筛选功能性基因;在体外成功分离培养和鉴定牛睾丸间充质干细胞,并使用维甲酸（Retinoic Acid,RA）诱导其向减数分裂前期分化,旨在鉴定体外诱导牛睾丸间充质干细胞向生殖细胞分化的可行性。通过激光显微切割系统,成功获取精原干细胞、初级精母细胞、圆形精子细胞和长形精子细胞,进行单细胞全基因组甲基化测序分析。研究结果表明,精子发生过程中DNA甲基化水平呈动态变化:精原干细胞到初级精母细胞呈高甲基化趋势;初级精母细胞到圆形精子细胞则是高甲基化与低甲基化交叉出现;圆形精子细胞到长形精子细胞则再次表现出高甲基化状态,揭示DNA甲基化对精子发生过程具有调控作用。差异甲基化区域（Differentially methylated regions,DMR）相关基因筛选发现,DNA水平差异最明显的初级精母细胞与精原干细胞组中存在16134个差异基因,圆形精子细胞与初级精母细胞对比组中存在91个DMR相关基因;长形精子细胞与圆形精子细胞对比组中存在97个DMR相关基因。其中,初级精母细胞与精原干细胞组存在多种泛素-蛋白连接酶相关基因（TRI11、SH3R1、ZNRF1、MARH8）和组蛋白-赖氨酸-甲基转移酶相关的基因（KMT2C、EHMT1、SMYD3、NSD3）,表明在精子发生过程中泛素-蛋白连接酶可能发挥重要作用,且DNA甲基化与组蛋白修饰保持密切联系。DMR相关基因KEGG分析表明,初级精母细胞与精原干细胞对比组间,Rap1信号通路在调节生殖细胞-支持细胞粘附中具有重要作用,可能是精子发生过程中重要的信号通路。体外成功分离培养牛睾丸间充质干细胞,RT-PCR鉴定该细胞表达CD105、CD166,流式细胞分析鉴定该细胞表达CD44、CD90、CD166且阳性率均在98%以上;克隆形成能力鉴定表明该细胞在体外具备自我更新的潜能;成功诱导为脂肪细胞和成骨细胞,表明该细胞在体外具备多向分化潜能;并使用RA诱导该细胞进入减数分裂阶段。因此可以选取牛睾丸间充质干细胞为研究对象,结合筛选获取的差异基因,在体外研究其向生殖细胞的诱导分化,为建立完整的体外诱导干细胞分化形成生殖细胞奠定基础。
李忠邦[9]（2019）在《LYZL4,LYZL6和PCNA在牦牛睾丸中的表达定位及组织学分析》文中提出哺乳动物精子的发生受到众多因素的调控。为保证优良的精液品质,必须确保精子发生过程的顺利进行。研究发现人源溶菌酶同源蛋白4（Human LysozymeLike 4,LYZL4）、人源溶菌酶同源蛋白6（Human Lysozyme-Like 6,LYZL6）以及增殖细胞核抗原（Proliferation cell nucleus antigen,PCNA）在雄性动物睾丸的正常发育以及精子发生过程中发挥着重要的作用。但是对于这几个基因的研究主要还停留在模式动物小鼠和人方面,对牦牛而言这几个基因的研究处于空缺状态。因此,通过对牦牛睾丸组织形态学的观察,研究牦牛睾丸组织的结构功能和变化规律,从而为为牦牛的繁殖生理研究提供一定的补充;同时探究LYZL4、LYZL6以及PCNA基因在牦牛睾丸中的表达与定位,对阐明牦牛精子发生的分子调节机制具有重大意义。本研究选取健康状况良好的6月龄、18月龄、30月龄及72月龄牦牛公牛各3头。通过组织形态学探讨不同月龄牦牛睾丸生精小管和间质细胞的发育及其变化规律。应用荧光实时定量PCR（quantitative real-time PCR）和Western Blot在转录和翻译水平上分别对LYZL4、LYZL6以及PCNA在不同月龄牦牛睾丸中的表达机制进行研究。同时采用免疫组织化学的方法对不同月龄牦牛睾丸中LYZL4、LYZL6以及PCNA蛋白的免疫阳性分布进行研究,从而初步探究这三个基因在牦牛睾丸中的调控机制。主要研究结果如下:1.在不同月龄中各细胞数量及支持细胞和曲细精管的长短径均有着极显着的变化（P<0.01）,而精原细胞、精母细胞以及间质细胞长短径没有显着性差异（P>0.05）。通过组织切片观察发现,随着牦牛年龄的不断增加,曲细精管越发排列紧密,管腔明显增大增粗。同时各级生精细胞也在逐渐增多,在72月龄时达到最多。说明72月龄是牦牛最佳的繁殖时期,表明各级生精细胞以及曲细精管是随着年龄的变化而有规律的发生改变。2.72月龄牦牛睾丸中LYZL4基因的表达极显着高于6月龄、18月龄和30月龄（P<0.01）;其表达量随着年龄的增长而升高,在性成熟期间乃至成年牛中高表达。LYZL4蛋白主要定位于牦牛睾丸组织中的圆形精子细胞和间质细胞,其蛋白表达在性成熟时期相对较高,30月龄和72月龄的蛋白表达量极显着高于6月龄和18月龄（P<0.01）。表明LYZL4参与精子发生的过程并且对牦牛睾丸的发育及成熟具有重要的调控作用。3.LYZL6基因高表达于成年牦牛的睾丸组织中,而性成熟前牦牛睾丸中LYZL6基因的表达量相对较低,72月龄睾丸与6、18和30月龄睾丸表达量存在极显着差异（P<0.01）;LYZL6蛋白定位于初级精母细胞和睾丸的圆形精子细胞以及成熟附睾精子的顶体前区和中段。性成熟前蛋白的表达量极显着低于性成熟后（P<0.01）。表明LYZL6在牦牛睾丸中主要通过影响精母细胞的增值来调控精子的发生过程。4.PCNA基因在性成熟以及成年牦牛的睾丸组织中高表达,性成熟前和性成熟后的表达量存在较大的差异,30月龄和72月龄牦牛睾丸中的表达量极显着高于6月龄和18月龄（P<0.01）。PCNA蛋白性成熟后睾丸中表达量极显着高于性成熟前（P<0.01）,而30月龄的蛋白表达显着高于72月龄（P<0.05）。免疫组化检测发现其主要定位于初级精母细胞、次级精母细胞以及部分支持细胞,表明PCNA通过影响睾丸间质细胞的增值和精母细胞的分裂来调控精子发生的过程。
徐传飞[10]（2019）在《犏牛精子发生阻滞相关microRNA鉴定与功能分析》文中认为犏牛是雄性普通牛和雌性牦牛的种间F1代杂种,生产性能显着优于亲本,对青藏高原恶劣气候环境也具有杰出的适应能力,但雄性犏牛因精子发生阻滞不育极大的限制了其在牦牛杂交育种中的有效利用。miRNA作为一类非编码小RNA在转录后水平通过影响靶mRNA的稳定性或者抑制蛋白翻译过程从而调控基因的表达水平。为了解miRNA在犏牛精子发生阻滞中可能的调控作用,本研究通过illumina深度测序筛选鉴定牦牛及犏牛睾丸组织间差异表达miRNA;并初步分析了bta-miR-34c调控牦牛精原细胞分化的分子机制。结果如下:（1）通过牦牛与犏牛睾丸组织TUNEL-POD染色分析发现,犏牛睾丸组织生精小管内只有单层附着在生精小管基底膜的精原细胞以及少量精母细胞,无圆形或延伸的精子细胞,并且精原细胞最早开始发生凋亡,至精母细胞时期加重,从而导致后续精子发生中断以致无精子生成;（2）通过牦牛与犏牛睾丸组织转录组miRNA高通量测序以及生物信息学分析发现,61个miRNA在犏牛与牦牛睾丸组织之间差异表达显着,其中miR-19b-3p、miR-592、miR-135a、miR-378和miR-184参与SSCs自我更新以及分化过程;miR-34c和miR-449a参与精子发生减数分离起始过程;（3）通过STA-PUT自然沉降法分离得到纯度较高的牦牛精原细胞和精母细胞;RT-PCR表型鉴定发现牦牛精原细胞呈CD9以及UCHL1阳性,精母细胞呈Tesmin以及SYCP3阳性;（4）通过分别转染牦牛精原细胞bta-miR-34c mimic以及inhibitor后发现,bta-miR-34c可能通过抑制CD4以及CDC25A的活性降低E2F转录因子的表达,从而促进精原细胞由有丝分裂向减数分裂转变的分化过程;同时还可能通过抑制HDAC1以及SIRT1的表达以激活p53通路诱导生殖细胞凋亡,以维持生精小管内生精细胞数目稳态。
二、Identification of differentially expressed genes of primary spermatocyte against round spermatid isolated from human testis using the laser capture microdissection technique（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Identification of differentially expressed genes of primary spermatocyte against round spermatid isolated from human testis using the laser capture microdissection technique（论文提纲范文）
（1）基于比较转录组学方法研究牛精子变形机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 精子变形研究现状 |
| 1.1.1 表观遗传修饰在精子变形过程中的作用 |
| 1.1.2 ART3 研究进展 |
| 1.1.3 ART3 在生物体内各器官表达情况 |
| 1.2 转录组数据分析原理概述及功能基因挖掘 |
| 1.2.1 原始数据质控 |
| 1.2.2 转录组测序数据的功能基因发掘 |
| 1.3 三甲氧基苯甲酰胺(3-Methoxybenzamide,3-MBA)研究现状 |
| 1.4 本研究的目的、方法及意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 小鼠饲料 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.1.5 实验试剂 |
| 2.1.6 实验试剂配制 |
| 2.1.7 计算机软件及数据库网址 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 牛RNA-Seq分析 |
| 2.2.2 RT-qPCR 验证牛 RNA-Seq 结果 |
| 2.2.3 小鼠RNA-Seq数据下载与分析 |
| 2.2.4 对小鼠和牛睾丸冰冻切片进行 ART3 免疫荧光检测 |
| 2.2.5 小鼠和牛睾丸石蜡切片制备 |
| 2.2.6 小鼠和牛ART3 免疫组化检测分析 |
| 2.2.7 石蜡切片的 ART3 免疫荧光光密度检测分析 |
| 2.2.8 小鼠和牛睾丸H&E染色步骤 |
| 2.2.9 小鼠睾丸裂解液的 ART3 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)实验 |
| 2.2.10 小鼠ART3 互作蛋白的SDS-PAGE分离及银染检测 |
| 2.2.11 小鼠ART3 互作蛋白的质谱鉴定 |
| 2.2.12 小鼠睾丸的ART3 抑制剂注射实验 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 牛精子细胞及精子转录组测序结果 |
| 3.2 牛和小鼠精子细胞及精子转录本的PCA分析 |
| 3.3 牛RNA-SEQ结果的RT-QPCR实验验证 |
| 3.4 牛精子变形期间DEGS筛选 |
| 3.5 牛精子变形期间DEGS的富集分析和PPI分析 |
| 3.5.1 圆形到长形精细胞期间上调基因的富集分析和PPI分析 |
| 3.5.2 圆形到长形精细胞期间下调基因的富集分析和PPI分析 |
| 3.5.3 长形到附睾尾精子期间上调基因的富集分析和 PPI 分析 |
| 3.5.4 长形到附睾尾精子期间下调基因的富集分析和 PPI 分析 |
| 3.6 小鼠精子DGES筛选 |
| 3.7 小鼠精子变形期间DEGS的富集分析 |
| 3.7.1 圆形到长形精细胞期间上调基因富集分析 |
| 3.7.2 圆形到长形精细胞期间下调基因富集分析 |
| 3.7.3 长形精细胞到附睾尾精子期间上调基因富集分析 |
| 3.7.4 长形精细胞到附睾尾精子期间下调基因富集分析 |
| 3.8 牛精子变形DGES与小鼠精子变形转录组同源基因的趋势分析 |
| 3.9 牛和小鼠同源同趋势DEGS的富集分析和PPI分析 |
| 3.10 牛和小鼠睾丸组织ART3 免疫荧光染色结果 |
| 3.11 牛ART3 蛋白的生物信息学分析 |
| 3.12 小鼠免疫沉淀结合质谱分析筛选与ART3 相互作用的蛋白 |
| 3.13 ART3 抑制剂对小鼠精子发生的影响 |
| 3.13.1 不同剂量3-MBA处理对精子质量的影响 |
| 3.13.2 3-MBA处理对睾丸精子发生的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 本研究的创新点与特色 |
| 5.3 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析（论文提纲范文）
| 本项研究受下列基金资助 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写与符号清单 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪睾丸发育过程及其表观遗传调控 |
| 1.1.1 公猪的性成熟 |
| 1.1.2 猪睾丸发育过程 |
| 1.1.3 间质细胞在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.1.4 睾丸发育与精子发生的表观遗传调控 |
| 1.2 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.1 环状RNA的生物起源、特性及功能 |
| 1.2.2 环状RNA的数据发掘、分析及研究方法 |
| 1.2.3 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.4 结论和展望 |
| 1.3 m6A修饰在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.3.1 m6A修饰概述 |
| 1.3.2 m6A修饰的检测 |
| 1.3.3 m6A修饰的生物学功能 |
| 1.3.4 哺乳动物精子发生过程中m6A修饰的动态调节 |
| 1.3.5 结论与展望 |
| 第二章 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学观察与分析 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 睾丸大小 |
| 2.2.2 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学特征 |
| 2.2.3 睾丸组织显微观察结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 石蜡切片及H&E染色 |
| 2.3.2 性成熟前后长白种公猪睾丸发育情况 |
| 2.3.3 性成熟前后长白种公猪睾丸组织结构观察 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 性成熟前后公猪睾丸文库构建及环状RNA的鉴定与基本特征 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 睾丸组织样本RNA提取及质检结果 |
| 3.2.2 RNA文库构建及高通量测序数据质量分析 |
| 3.2.3 环状RNA的鉴定 |
| 3.2.4 性成熟前后长白种公猪睾丸组织中环状RNA的基本特征 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 性成熟前后长白种公猪睾丸环状RNA的差异表达及生物信息学分析 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 性成熟前后公猪睾丸组织中显着差异表达环状RNA的鉴定与分析 |
| 4.2.2 性成熟前后公猪睾丸组织环状RNA测序结果的试验验证 |
| 4.2.3 差异环状RNA的GO分析 |
| 4.2.4 差异环状RNA的 KEGG信号通路富集分析 |
| 4.2.5 环状RNA靶miRNA预测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 性成熟前后长白种公猪睾丸转录组信使RNA甲基化图谱的建立 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 数据质控与序列统计 |
| 5.2.2 参考基因组比对 |
| 5.2.3 全基因组m6A Peak扫描分析 |
| 5.2.4 差异Peak分析 |
| 5.2.5 m6A Motif分析 |
| 5.2.6 RNA-seq基因/转录本差异结果分析 |
| 5.2.7 RNA-seq中差异基因GO富集分析 |
| 5.2.8 RNA-seq中差异基因KEGG富集分析 |
| 5.2.9 MeRIP-seq中差异m6A Peak GO富集分析 |
| 5.2.10 MeRIP-seq中差异m6A Peak KEGG富集分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）安格斯牛睾丸组织非编码RNA鉴定及单细胞转录图谱绘制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 牛睾丸发育 |
| 1.1.1 出生后牛睾丸生长发育 |
| 1.1.2 牛的精子发生 |
| 1.1.3 牛睾丸间质细胞和支持细胞发育 |
| 1.2 非编码RNA与睾丸发育 |
| 1.2.1 miRNA与睾丸发育 |
| 1.2.2 lncRNA与睾丸发育 |
| 1.2.3 circRNA与睾丸发育 |
| 1.2.4 ceRNA调控与睾丸发育 |
| 1.3 单细胞测序技术与睾丸发育 |
| 1.3.1 单细胞测序技术 |
| 1.3.2 单细胞测序技术在睾丸发育中的研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 安格斯牛睾丸组织不同时期lncRNA鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 切片制备和HE染色 |
| 2.2.2 总RNA提取 |
| 2.2.3 文库构建及测序 |
| 2.2.4 转录组测序数据分析 |
| 2.2.5 睾丸细胞的分离和RT-qPCR验证 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 睾丸组织的形态学检测 |
| 2.3.2 牛睾丸中lncRNA和 mRNA的测序信息 |
| 2.3.3 lncRNAs和 mRNA的基因组特征和表达谱分析 |
| 2.3.4 差异表达的mRNA富集分析 |
| 2.3.5 差异lncRNA靶基因富集分析 |
| 2.3.6 差异 lncRNA 及 mRNA 的表达谱验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 安格斯牛睾丸组织不同时期miRNA鉴定 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 总RNA提取 |
| 3.2.2 文库构建、测序及分析 |
| 3.2.3 RT-qPCR验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 牛睾丸小RNA测序文库质控分析 |
| 3.3.2 牛睾丸已知和新miRNA的鉴定和特征分析 |
| 3.3.3 性成熟前后睾丸差异表达的miRNA |
| 3.3.4 差异表达的miRNA靶基因预测 |
| 3.3.5 差异表达的miRNA靶基因富集分析 |
| 3.3.6 差异表达的miRNA RT-qPCR验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 安格斯牛睾丸组织不同时期circRNA鉴定 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 总RNA提取 |
| 4.2.2 文库构建及测序 |
| 4.2.3 测序结果分析 |
| 4.2.4 RT-qPCR验证 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 牛睾丸circRNA鉴定 |
| 4.3.2 初生期和性成熟期睾丸circRNA差异表达 |
| 4.3.3 差异表达circRNA宿主基因的富集分析 |
| 4.3.4 差异表达的circRNA RT-qPCR验证 |
| 4.3.5 circRNA-miRNA-mRNA网络的构建 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 circSMC1B通过靶向let-7i调控公牛生殖干细胞的增殖及凋亡 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 试验样品 |
| 5.1.2 主要试剂及仪器 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 circSMC1B全长扩增及载体构建 |
| 5.2.2 细胞增殖实验 |
| 5.2.3 细胞凋亡实验 |
| 5.2.4 RNA提取及cDNA合成及RT-qPCR实验 |
| 5.2.5 双荧光素酶报告系统载体构建 |
| 5.2.6 数据统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 circSMC1B鉴定 |
| 5.3.2 circSMC1B促进mGSCs细胞增殖 |
| 5.3.3 circSMC1B促进mGSCs细胞凋亡 |
| 5.3.4 circSMC1B竞争性结合let-7i |
| 5.3.5 let-7i抑制mGSCs细胞增殖 |
| 5.3.6 let-7i抑制mGSCs细胞凋亡 |
| 5.3.7 let-7i靶向HMGA1、NR6A1 调控mGSCs细胞增殖凋亡 |
| 5.3.8 circSMC1B竞争性结合let-7i促进mGSCs增殖凋亡 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 牛睾丸组织发育的单细胞转录图谱绘制 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.1.1 试验样品 |
| 6.1.2 主要试剂及仪器 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.2.1 睾丸单细胞悬液制备 |
| 6.2.2 单细胞测序基本流程 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 睾丸样本的HE染色 |
| 6.3.2 单细胞数据的质控和细胞类型鉴定 |
| 6.3.3 牛睾丸不同细胞群特异表达基因的鉴定分析 |
| 6.3.4 牛睾丸生殖细胞类型鉴定及分化过程 |
| 6.3.5 牛精原细胞基因动态表达 |
| 6.3.6 牛精母细胞基因动态表达 |
| 6.3.7 牛精子细胞基因动态表达 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）通过单细胞测序定义奶山羊精子发生综合路线图（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 精子发生的研究进展 |
| 1.1.1 精原干细胞 |
| 1.1.2 精母细胞 |
| 1.1.3 精子 |
| 1.1.4 睾丸体细胞 |
| 1.2 单细胞转录组测序(scRNAseq)在精子发生中的应用 |
| 1.2.1 scRNAseq在小鼠精子发生中的应用 |
| 1.2.2 scRNAseq在人类精子发生中的应用 |
| 1.3 本研究的目的意义 |
| 第二章 关中奶山羊睾丸单细胞转录图谱的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 主要分析软件及数据库 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 关中奶山羊睾丸单细胞悬液制备 |
| 2.2.2 单细胞测序 |
| 2.2.3 scRNA seq下游数据分析 |
| 2.2.4 Monocle细胞分化轨迹构建 |
| 2.2.5 GO富集和KEGG分析 |
| 2.2.6 不同细胞类群的鉴定 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 单细胞数据质控 |
| 2.3.2 奶山羊精子发生过程中的主要细胞类型鉴定 |
| 2.3.3 关中奶山羊精子发生过程中主要细胞类型的分子特征 |
| 2.3.4 关中奶山羊精子发生分化轨迹构建 |
| 2.3.5 关中奶山羊精原细胞探究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 关中奶山羊睾丸体细胞转录图谱 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试验样本 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.1.3 主要分析软件及数据库 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 Monocle细胞分化轨迹构建 |
| 3.2.2 GO富集分析和KEGG分析 |
| 3.2.3 切片免疫荧光染色 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 关中奶山羊体细胞簇分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 附件 |
（5）减数分裂过程中三维基因组研究与多组学研究技术的开发（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 染色质高级结构研究方法简介 |
| 1.1.1 基于3C的三维基因组结构研究方法简介 |
| 1.1.2 非3C依赖的三维基因组结构研究方法简介 |
| 1.1.3 单细胞水平的三维基因组结构研究方法 |
| 1.2 染色质高级结构简介 |
| 1.2.1 染色质领域和染色质隔室 |
| 1.2.2 染色质拓扑结构域和染色质环 |
| 1.3 染色质高级结构调控因子简介 |
| 1.3.1 参与染色质高级结构调控的蛋白 |
| 1.3.2 染色质高级结构相关的ncRNA |
| 1.4 染色质高级结构与转录调控简介 |
| 1.4.1 A/B compartments与转录调控简介 |
| 1.4.2 TADs、chromatin loops与转录调控简介 |
| 第二章 嗜热四膜虫三维基因组结构研究 |
| 2.1 绪论 |
| 2.1.1 嗜热四膜虫简介 |
| 2.1.2 嗜热四膜虫减数分裂简介 |
| 2.1.3 嗜热四膜虫大、小核基因组 |
| 2.2 研究成果 |
| 2.2.1 嗜热四膜虫中Hi-C实验体系的建立及小核数据的获取 |
| 2.2.2 嗜热四膜虫新月期小核特异的染色质相互作用 |
| 2.2.3 嗜热四膜虫大核的三维基因组结构 |
| 2.2.4 嗜热四膜虫小核的三维基因组结构 |
| 2.2.5 嗜热四膜虫小核中TAD-like结构与大核染色体形成相关 |
| 2.2.6 嗜热四膜虫三维基因组图谱与基因组组装 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.4 材料与方法 |
| 2.4.1 嗜热四膜虫细胞培养 |
| 2.4.2 嗜热四膜虫细胞饥饿 |
| 2.4.3 嗜热四膜虫细胞诱导接合生殖 |
| 2.4.4 嗜热四膜虫细胞的甲醛交联 |
| 2.4.5 嗜热四膜虫小核分离 |
| 2.4.6 嗜热四膜虫in situ Hi-C实验 |
| 2.4.7 嗜热四膜虫HiChIP实验 |
| 2.4.8 嗜热四膜虫Hi-C和HiChIP数据分析 |
| 第三章 小鼠精子发生过程中三维基因结构的研究 |
| 3.1 背景 |
| 3.1.1 小鼠精子发生过程简介 |
| 3.1.2 哺乳动物精子发生过程染色质高级结构的动态变化 |
| 3.2 研究成果 |
| 3.2.1 小鼠精子发生过程中不同时期细胞的分离 |
| 3.2.2 小鼠精子发生过程中染色质高级结构的动态变化 |
| 3.2.3 小鼠精子发生过程A/B compartments的动态重组 |
| 3.2.4 小鼠精子发生过程A/B compartments转换与基因表达调控 |
| 3.2.5 小鼠精子发生过程中TADs发生重组 |
| 3.2.6 小鼠精子发生过程中pacSC时期TADs的消失不依赖于CTCF/cohesin以及染色质开放性的改变 |
| 3.2.7 成熟精子中重建的chromatin loops与早期胚胎发育相关 |
| 3.2.8 减数分裂与有丝分裂过程染色质高级结构的对比 |
| 3.2.9 小鼠雄性Xi与雌性Xi的染色质高级结构的对比 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.4 材料与方法 |
| 3.4.1 实验动物 |
| 3.4.2 分离不同时期的精子细胞 |
| 3.4.3 免疫荧光 |
| 3.4.4 In situ Hi-C实验 |
| 3.4.5 ATAC-seq实验 |
| 3.4.6 Native ChIP-seq实验 |
| 3.4.7 数据分析 |
| 第四章 多组学及单细胞研究技术的开发 |
| 4.1 绪论 |
| 4.1.1 启动子-增强子间相互作用捕获技术简介 |
| 4.1.2 单细胞转录组与染色质开放性研究技术简介 |
| 4.2 研究成果 |
| 4.2.1 通过HiATAC捕获全基因范围内染色质开放区域间的相互作用 |
| 4.2.2 通过single-cell AR同时捕获单细胞转录组与染色质开放位点 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.4 材料与方法 |
| 4.4.1 细胞培养及传代 |
| 4.4.2 ATAC-seq实验 |
| 4.4.3 多聚甲醛交联细胞的ATAC-seq实验 |
| 4.4.4 多聚甲醛交联细胞HiATAC实验 |
| 4.4.5 未交联细胞Hi-C实验 |
| 4.4.6 未交联细胞HiATAC实验 |
| 4.4.7 群体细胞AR实验 |
| 4.4.8 单细胞AR实验 |
| 4.4.9 数据分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果 |
（6）水牛类精原干细胞体外培养及其相关调控关键基因挖掘的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(中英文对照表) |
| 第一部分 文献综述 |
| 1 精原干细胞的研究进展 |
| 1.1 精子发生与的精原干细胞起源与发展 |
| 1.2 精原干细胞干细胞龛 |
| 1.3 精原干细胞的分离与纯化 |
| 1.4 精原干细胞的表型鉴定 |
| 1.5 精原干细胞的体外培养 |
| 1.6 精原干细胞的体外分化及应用前景 |
| 2 干细胞的衰老 |
| 3 转录组学的研究与应用 |
| 3.1 单细胞转录组学的研究进展 |
| 3.2 单细胞转录组学的发展历程 |
| 3.3 单细胞转录组学测序的基本步骤 |
| 3.4 单细胞转录组学的应用 |
| 4 选题依据及研究内容 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1 不同体外培养系统对水牛类精原干细胞体外培养效果的影响 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 试验材料 |
| 1.2.1 主要试验试剂 |
| 1.2.2 试验材料来源 |
| 1.2.3 主要的实验仪器: |
| 1.2.4 主要溶液的配置 |
| 1.2.4.1 成分不明的SSC-like cells培养液的配置 |
| 1.2.4.2 成分明确的SSC-like cells培养液的配置 |
| 1.2.5 引物合成 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 水牛睾丸材料的收集 |
| 1.3.2 水牛睾丸组织的固定及石蜡包埋 |
| 1.3.3 水牛睾丸组织的石蜡切片免疫荧光染色 |
| 1.3.4 水牛睾丸总细胞的分离 |
| 1.3.5 水牛原代类精原干细胞的富集及抹片鉴定 |
| 1.3.6 细胞总RNA的提取以及荧光定量聚合酶链反应 |
| 1.3.7 不同体系对水牛类精原干细胞体外培养的效果对比及传代方法 |
| 1.3.8 体外培养水牛类精原干细胞的功能鉴定 |
| 1.4 试验结果 |
| 1.4.1 水牛睾丸组织的石蜡切片免疫荧光染色 |
| 1.4.2 水牛原代类精原干细胞的富集及抹片鉴定 |
| 1.4.3 水牛类精原干细胞在不同培养体系中的体外培养 |
| 1.4.4 在成分明确的培养体系中使用RA进行体外诱导 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 小结 |
| 2 成年与幼年水牛曲细精管的差异转录组学研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 生物信息学分析工具 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.2.5 引物合成 |
| 2.2.6 实验过程 |
| 2.2.6.1 水牛睾丸组织的固定及石蜡包埋 |
| 2.2.6.2 水牛睾丸曲细精管HE切片染色 |
| 2.2.6.3 水牛睾丸曲细精管的分离 |
| 2.2.6.4 水牛睾丸曲细精管转录组测序基本流程 |
| 2.2.6.5 Gene Ontology(GO)和 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)富集分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 成年水牛曲细精管和幼年水牛曲细精管HE染色分析 |
| 2.3.2 成年水牛曲细精管和幼年水牛曲细精管转录组的差异分析 |
| 2.3.3 幼年水牛曲细精管相对于成年水牛曲细精管显着上调基因集的分析 |
| 2.3.4 幼年水牛曲细精管相对于成年水牛曲细精管显着下调基因集的分析 |
| 2.3.5 qRT-PCR的验证 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 成年和幼年水牛的类精原干细胞差异转录组学研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 生物信息学分析工具 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.2.4 引物合成 |
| 3.3 实验过程 |
| 3.3.1 水牛睾丸单细胞悬液的获取 |
| 3.3.2 THY1阳性单细胞的获取 |
| 3.3.3 水牛类精原干细胞的免疫鉴定 |
| 3.3.4 单细胞转录组的扩增 |
| 3.3.5 单细胞转录组测序文库的建立 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 成年与幼年水牛类精原干细胞的分离与鉴定 |
| 3.4.2 水牛睾丸中类精原干细胞mRNA转录组图谱的构建 |
| 3.4.3 成年和幼年水牛类精原干细胞转录组的差异分析 |
| 3.4.4 幼年水牛类精原干细胞相对于成年水牛类精原干细胞显着上调表达基因集的分析 |
| 3.4.5 幼年水牛类精原干细胞相对于成年水牛类精原干细胞显着下调表达基因集的分析 |
| 3.4.6 qRT-PCR的验证 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 总结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
（7）TGF-β3通过Lgl2调节大鼠血睾屏障及睾丸支持细胞乳酸分泌功能的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :miR-142-3p通过靶向Lgl2 抑制TGF-β3 诱导的血睾屏障功能损伤 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠原代Sertoli细胞分离培养、转染及加药处理 |
| 2.2.2 跨上皮电阻测定(TER) |
| 2.2.3 荧光素钠(Na-F)通透率检测 |
| 2.2.4 大鼠体内给药处理 |
| 2.2.5 大鼠体内BTB屏障功能检测 |
| 2.2.6 免疫荧光 |
| 2.2.7 激光捕获显微切割(LCM) |
| 2.2.8 实时荧光定量PCR(q PCR) |
| 2.2.9 免疫印迹 |
| 2.2.10 荧光素酶报告基因实验 |
| 2.2.11 免疫共沉淀 |
| 2.2.12 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 TGF-β3、miR-142-3p、Lgl2 在大鼠生精上皮周期中存在阶段特异性表达 |
| 3.2 miR-142-3p抑制TGF-β3 诱导的大鼠原代Sertoli细胞屏障功能减退 |
| 3.3 miR-142-3p拮抗TGF-β3 诱导的大鼠体内BTB屏障功能损伤 |
| 3.4 miR-142-3p通过靶向Lgl2-3'UTR抑制Lgl2 蛋白表达 |
| 3.5 miR-142-3p 抑制 TGF-β3 诱导的 Lgl2 蛋白表达升高 |
| 3.6 沉默 Lgl2 部分拮抗 TGF-β3 诱导的大鼠原代 Sertoli 细胞屏障功能减退 |
| 4 实验讨论 |
| 5 实验结论 |
| 第二部分 :TGF-b3 通过上调 Lgl2 的表达抑制 Notch 信号通路活性从而促进 Sertoli 细胞乳酸分泌 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 实验动物与细胞系 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠原代 Sertoli 细胞分离培养、转染及加药处理 |
| 2.2.2 TM4 细胞培养、转染及加药处理 |
| 2.2.3 乳酸含量测定 |
| 2.2.4 葡萄糖消耗量测定 |
| 2.2.5 线粒体活性检测 |
| 2.2.6 乳酸脱氢酶活性检测 |
| 2.2.7 谷氨酰胺酶活性检测 |
| 2.2.8 谷氨酰胺消耗量测定 |
| 2.2.9 大鼠体内给药处理 |
| 2.2.10 免疫组化 |
| 2.2.11 HE染色 |
| 2.2.12 实时荧光定量PCR(q PCR) |
| 2.2.13 免疫印迹(步骤同第一部分) |
| 2.2.14 激光捕获显微切割(LCM)(步骤同第一部分) |
| 2.2.15 跨上皮电阻测定(TER)(步骤同第一部分) |
| 2.2.16 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 TGF-b3 促进 Sertoli 细胞糖酵解及乳酸分泌 |
| 3.2 Lgl2 参与 TGF-b3 对 Sertoli 细胞乳酸分泌的调控作用 |
| 3.3 抑制Notch信号通路拮抗Lgl2 沉默引起的Sertoli细胞乳酸分泌减少 |
| 3.4 Jagged1 在大鼠生精上皮周期中存在阶段特异性表达 |
| 3.5 Notch信号通路活化导致精子发生障碍 |
| 4 实验讨论 |
| 5 实验结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）牛精子发生过程中甲基化分析及干细胞向精子诱导分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 DNA甲基化 |
| 1.1.1 DNA甲基化概述 |
| 1.1.2 DNA甲基化检测方法 |
| 1.2 精子发生 |
| 1.2.1 精子发生过程 |
| 1.2.2 减数分裂过程中的细胞形态 |
| 1.3 精子发生过程中的DNA甲基化 |
| 1.3.1 精子发生过程中的DNA甲基化 |
| 1.3.2 精子发生过程中的DNA甲基化与男性不育 |
| 1.3.3 DNA甲基化在牛遗传育种中的应用 |
| 1.3.4 干细胞体外诱导为生殖细胞 |
| 1.4 技术路线 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂配制 |
| 2.2 牛精子发生过程中的甲基化分析 |
| 2.2.1 精子发生过程中不同类型的单细胞获取 |
| 2.2.2 单细胞DNA甲基化分析 |
| 2.3 牛睾丸间充质干细胞体外诱导分化为生殖细胞 |
| 2.3.1 牛睾丸间充质干细胞的分离培养 |
| 2.3.2 牛睾丸MSCs的生物学鉴定 |
| 2.3.3 牛睾丸 MSCs 向生殖细胞诱导 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 精子发生过程中不同类型的单细胞获取 |
| 3.2 单细胞DNA甲基化测序分析 |
| 3.2.1 测序数据质量评估 |
| 3.2.2 参考序列比对 |
| 3.2.3 甲基化位点检测及分析 |
| 3.2.4 单样本甲基化分析 |
| 3.2.5 相关性和聚类热图分析 |
| 3.2.6 比较组合甲基化水平联合作图 |
| 3.2.7 DMR分析 |
| 3.2.8 DMR相关基因GO富集分析 |
| 3.2.9 DMR相关基因 |
| 3.2.10 DMR相关基因KEGG信号通路富集分析 |
| 3.3 牛睾丸MSCs体外诱导分化为生殖细胞 |
| 3.3.1 牛睾丸MSCs的分离培养 |
| 3.3.2 牛睾丸MSCs的生物学鉴定 |
| 3.3.3 牛睾丸MSCs向生殖细胞诱导 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 单细胞WGBS分析 |
| 4.2 干细胞体外诱导为生殖细胞 |
| 4.3 今后研究计划 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）LYZL4,LYZL6和PCNA在牦牛睾丸中的表达定位及组织学分析（论文提纲范文）
| 缩略词中英文对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 雄性生殖器官——睾丸 |
| 1.1 睾丸组织主要结构 |
| 1.1.1 曲细精管 |
| 1.1.2 生精上皮 |
| 1.1.3 支持细胞 |
| 2 精子发生 |
| 2.1 功能结构 |
| 2.1.1 睾丸间质 |
| 2.1.2 血-睾屏障 |
| 2.1.3 精原细胞 |
| 2.2 精子发生的过程简介 |
| 2.3 精子发生的内分泌调节 |
| 2.3.1 自上而下的正向调节 |
| 2.3.2 自下而上的反馈调节 |
| 3 精子发生相关基因研究进展 |
| 3.1 溶菌酶简介 |
| 3.1.1 LYZL4 基因 |
| 3.1.2 LYZL6 基因 |
| 3.2 PCNA基因 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第二章 牦牛睾丸组织形态学观察 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 牦牛睾丸组织样本采集 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.2.1 主要试剂和耗材 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 睾丸组织石蜡切片的制备 |
| 1.3.2 HE染色 |
| 1.3.3 数据收集 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牦牛睾丸组织切片观察 |
| 2.1.1 牦牛睾丸曲细精管与各细胞长短径及各细胞数量的变化 |
| 2.1.2 牦牛睾丸形态学变化 |
| 3 讨论 |
| 第三章 牦牛睾丸中LYZL4、LYZL6及PCNA基因mRNA的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 牦牛睾丸组织样本采集 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.2.1 主要试剂和耗材 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 总RNA的提取和反转录 |
| 1.3.2 引物设计及合成 |
| 1.3.3 牦牛睾丸组织中LYZL4、LYZL6及PCNA基因的表达分析 |
| 1.3.4 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牦牛睾丸LYZL4 基因mRNA的表达 |
| 2.2 牦牛睾丸LYZL6 基因mRNA的表达 |
| 2.3 牦牛睾丸PCNA基因mRNA的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 LYZL4 mRNA在牦牛睾丸中的表达 |
| 3.2 LYZL6 基因mRNA在牦牛睾丸中的表达 |
| 3.3 PCNA mRNA在牦牛睾丸中的表达 |
| 第四章 牦牛睾丸中LYZL4、LYZL6及PCNA蛋白的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 牦牛睾丸组织样本采集 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.2.1 主要试剂和耗材 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 组织总蛋白的提取及变性 |
| 1.3.2 Western blot |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牦牛睾丸中LYZL4 蛋白的表达 |
| 2.2 牦牛睾丸中LYZL6 蛋白的表达 |
| 2.3 牦牛睾丸中PCNA蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 牦牛睾丸中LYZL4 蛋白的表达 |
| 3.2 牦牛睾丸中LYZL6 蛋白的表达 |
| 3.3 牦牛睾丸中PCNA蛋白的表达 |
| 第五章 牦牛睾丸中LYZL4、LYZL6及PCNA蛋白的定位 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 牦牛睾丸组织样本采集 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.2.1 主要试剂和耗材 |
| 1.2.2 主要仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 免疫组织化学染色 |
| 1.3.2 图像采集 |
| 1.3.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牦牛睾丸组织中LYZL4 蛋白的免疫组化染色 |
| 2.2 牦牛睾丸组织中LYZL6 蛋白的免疫组化染色 |
| 2.3 牦牛睾丸组织中PCNA蛋白的免疫组化染色 |
| 3 讨论 |
| 3.1 牦牛睾丸组织中LYZL4 蛋白的免疫组化染色 |
| 3.2 牦牛睾丸组织中LYZL6 蛋白的免疫组化染色 |
| 3.3 牦牛睾丸组织中PCNA蛋白的免疫组化染色 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（10）犏牛精子发生阻滞相关microRNA鉴定与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 犏牛雄性不育的研究现状 |
| 1.2 miRNA的研究概述 |
| 1.2.1 miRNA的发现 |
| 1.2.2 miRNA的来源 |
| 1.3 miRNA在精子发生过程中的调控作用 |
| 1.3.1 miRNA对原始生殖细胞的影响 |
| 1.3.2 miRNA对精原细胞自我更新以及分化的影响 |
| 1.3.3 miRNA对精母细胞减数分裂以及精子形成的影响 |
| 1.3.4 miRNA相关蛋白对于精子发生的影响 |
| 1.4 精原干细胞分离鉴定研究现状 |
| 1.4.1 精原干细胞的分离富集 |
| 1.4.2 两步酶消化法 |
| 1.4.3 单位重力沉降 |
| 1.4.4 不连续Percoll密度梯度离心 |
| 1.4.5 免疫磁珠细胞分选 |
| 1.4.6 流式细胞分选技术 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达miRNA分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要的仪器设备 |
| 2.1.3 主要的试剂 |
| 2.1.4 牦牛及犏牛睾丸组织石蜡切片 |
| 2.1.5 牦牛及犏牛睾丸组织TUNEL-POD检测 |
| 2.1.6 RNA提取 |
| 2.1.7 miRNA克隆测序以及数据分析 |
| 2.1.8 差异表达miRNA分析 |
| 2.1.9 差异表达miRNA靶基因预测以及GO条目KEGG通路富集分析 |
| 2.1.10 差异表达miRNA及其靶基因RT-qPCR验证 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 牦牛及犏牛睾丸组织细胞凋亡分析 |
| 2.2.2 小RNA分类 |
| 2.2.3 差异表达miRNA鉴定 |
| 2.2.4 靶基因预测以及通路富集分析 |
| 2.2.5 差异表达miRNA及其靶基因RT-qPCR验证 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 差异表达miRNA在精原细胞自我更新与分化过程中的调控作用 |
| 2.3.2 差异表达miRNA在精母细胞减数分裂过程中的调控作用 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 bta-miR-34c对牦牛精原细胞分化的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要的仪器设备 |
| 3.1.3 主要的试剂 |
| 3.1.4 牦牛生精细胞单细胞悬液制备 |
| 3.1.5 牦牛生精细胞STA-PUT自然沉降分离 |
| 3.1.6 牦牛生精细胞总RNA提取以及RT-PCR表型鉴定 |
| 3.1.7 牦牛精原细胞bta-miR-34c转染 |
| 3.1.8 牦牛精原细胞转染bta-miR-34c后相关基因RT-qPCR检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 牦牛生精细胞的分离鉴定 |
| 3.2.2 牦牛精原细胞bta-miR-34c过表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
四、Identification of differentially expressed genes of primary spermatocyte against round spermatid isolated from human testis using the laser capture microdissection technique（论文参考文献）
- [1]基于比较转录组学方法研究牛精子变形机制[D]. 李欣. 中国农业科学院, 2021(01)
- [2]长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析[D]. 张飞. 安徽农业大学, 2021
- [3]安格斯牛睾丸组织非编码RNA鉴定及单细胞转录图谱绘制[D]. 高源. 西北农林科技大学, 2021
- [4]通过单细胞测序定义奶山羊精子发生综合路线图[D]. 于秀伟. 西北农林科技大学, 2021
- [5]减数分裂过程中三维基因组研究与多组学研究技术的开发[D]. 罗正誉. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [6]水牛类精原干细胞体外培养及其相关调控关键基因挖掘的研究[D]. 李婷婷. 广西大学, 2019(02)
- [7]TGF-β3通过Lgl2调节大鼠血睾屏障及睾丸支持细胞乳酸分泌功能的机制研究[D]. 徐荧. 中国医科大学, 2019(01)
- [8]牛精子发生过程中甲基化分析及干细胞向精子诱导分化的研究[D]. 朱婉婉. 中国农业科学院, 2019(09)
- [9]LYZL4,LYZL6和PCNA在牦牛睾丸中的表达定位及组织学分析[D]. 李忠邦. 西北民族大学, 2019
- [10]犏牛精子发生阻滞相关microRNA鉴定与功能分析[D]. 徐传飞. 西南科技大学, 2019(11)