一、Expression and characterization of Mac-1-FP fusion protein in CHO cells（论文文献综述）
刘安远[1]（2021）在《新型pH敏感红色荧光蛋白及其在囊泡分泌中的应用》文中研究说明囊泡的转运和融合具有重要的生理意义,它的功能障碍会引起很多疾病,因而一直是生物学研究的前沿热点。但囊泡分泌是由多种蛋白质分子介导的多步骤动态过程,该过程还涉及与钙信号、囊泡胞吞等相关事件在时间和空间上的耦联和精确调控,其复杂的分子机制目前依然有很多未知之处。而研究工作受阻的其中一个重要原因是缺乏相应的技术手段。如何在活细胞中以高的时空分辨率可视化囊泡分泌及耦联事件是目前需要突破的技术难点,这对于揭示囊泡分泌及相关生物学事件的分子机制具有重要的研究意义。目前对囊泡分泌过程的超高分辨追踪仍面临一系列挑战,其中一个关键的技术瓶颈是缺少合适的可视化荧光蛋白探针。被广泛使用的Super Ecliptic pHLuorin（SEP）,是一种pH敏感的绿色荧光蛋白（GFP）,它对于无创监测胞吐融合事件非常有利,已被广泛用于单个囊泡胞吐的成像。然而,由于囊泡内部的酸性环境造成SEP荧光信号太低而无法观察到与细胞膜融合之前的囊泡,因此无法使用SEP可视化锚定（docking）步骤。在可用的红色pH敏感荧光蛋白中,由于未优化的pH敏感度、荧光亮度或严重的光不稳定行为,在实际应用中没有一种可与SEP相提并论。因此急需一种可同时监测囊泡锚定和融合的红色pH敏感荧光蛋白,且该蛋白最好还适用于高时空分辨率成像。在这篇论文中,我们开发了一种明亮且光稳定的红色pH敏感型荧光蛋白,命名为pHmScarlet。与其他红色pH敏感荧光蛋白相比,它具有最高的pH敏感度,当pH从5.5增加到7.5时,荧光强度变化约为26倍,因此它很适合监测囊泡融合事件。pHmScarlet在活细胞中的荧光亮度是pHuji的7倍,并且没有pHuji的光开关行为等光不稳定性质。使用pHmScarlet能够同时检测单个囊泡锚定和融合步骤。此外,由于pHmScarlet的发射峰为585 nm,因此可以与SEP结合使用,对两个单独的分泌事件或同一个分泌事件的不同蛋白进行双色成像。最后,尽管与SEP相比,pHmScarlet的发射波长是红移的,但使用Hessian结构光照明显微镜（Hessian-SIM）,其空间分辨率依然足以解析出囊泡融合孔的环形结构,在这篇论文中我们首次观察到红色荧光蛋白标记的融合孔结构。总的来说,我们开发的pHmScarlet是pH敏感性最高的新型红色荧光蛋白,且十分明亮和稳定。pHmScarlet适合囊泡分泌事件的长时程追踪和超高分辨检测,它在神经细胞和其他分泌细胞研究中有巨大的应用潜力,是未来神经科学研究的利器。
刘雨璐,朱晓霞,顾若兰,甘慧,窦桂芳,孟志云[2]（2021）在《重组活化凝血因子Ⅶ药物的临床应用和研发现状》文中认为凝血因子Ⅶ（FⅦ）是一种维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶,作为外源性凝血途径的启动子,主要用于体内产生FⅧ或FⅨ抑制剂的血友病A或B患者的治疗。重组活化凝血因子Ⅶ（rFⅦa）是FⅦ制品最主要的产品,在临床得到广泛的应用。为进一步提高患者疗效和用药顺应性,长效rFⅦa成为当前国际上的研究热点。该文综述了rFⅦa的药理特性、临床应用以及新型在研rFⅦa药物研究进展,为后续研究提供参考。
冷双[3]（2017）在《SNAP-tag荧光探针与细胞内蛋白标记应用研究》文中研究说明蛋白质是细胞的重要组成部分,是生命活动的主要承担者。蛋白质的种类繁多,至今还有很多蛋白的性质未知,因此,对活细胞内蛋白质进行特异性荧光标记的技术应运而生。蛋白荧光标记技术因能够可视化的观测活细胞内蛋白质的结构与功能而被科学家们广泛应用。目前常用的蛋白荧光标记技术包括基因编码的荧光蛋白法、非天然氨基酸法和自标记蛋白标签技术。但是荧光蛋白存在分子量较大、荧光光谱单一等缺点,而非天然氨基酸法前期基因改造复杂使其应用存在一定的局限性。因此自标记蛋白标签技术被广泛的应用于研究活细胞中蛋白质的定位和动态功能。至今,已经开发了各种蛋白质标签以研究活体中的蛋白质系统,SNAP-tag是其中最优秀的融合标签之一。SNAP-tag是人源DNA烷基转移酶（hAGT）的变体,它能够专一性的与O6-苄基鸟嘌呤（O6-benzylguanine,BG）及其衍生物共价连接。目前,各种连接BG底物的荧光探针已被设计出来,而且能专一、快速、不可逆地与SNAP–tag共价连接,这使其广泛应用于药物监测、蛋白质-蛋白质相互作用、荧光传感器、和超分辨显微镜。虽然已经发现了很好的荧光探针,但是由于背景光较强这些探针需要在成像之前清除。这不仅耗费时间,而且这种清洗可能会影响实时监测一些分子内部的活动（例如受体-配体结合、内吞作用、物质运输等）。此外,因为多余的荧光探针容易在各种细胞器中堆积,我们很难做到完全清除。因此,为了克服这些困难,开发了新的具有开关效应的荧光探针。本文采用SNAP-tag蛋白标签技术,用新型的荧光探针标记体内的蛋白,能够在免洗的条件下实时监控蛋白在细胞内的分布。基于此,本论文主要做了以下工作:首先,基于荧光团的环境敏感与淬灭机制,我们设计合成了一系列基于1,8-萘酰亚胺荧光团的荧光探针BGAN-R（R=2C、8C、12C、DM）。通过荧光检测、动力学检测等一系列实验我们发现BGAN-2C能够快速、专一的与SNAP-tag共价反应,并且荧光显着增强。该探针细胞毒性小,在活细胞成像实验中,其能够快速地标记细胞内特定的蛋白质。随后,基于光诱导电子转移机制我们设计合成了BGAN-DPA探针。通过荧光检测、动力学等研究,发现BGAN-DPA与SNAP-tag蛋白结合后荧光显着增强。并且结合后的蛋白-探针复合物对铜离子有专一性响应。最后将BGAN-DPA应用到HEK 293细胞的生物成像研究中,在免洗条件下实现了细胞内线粒体上蛋白的标记及铜离子的检测。综上所述,通过设计合成的新型荧光探针,实现了SNAP-tag蛋白在细胞内的可视化追踪以及细胞内铜离子的检测,并且不需要任何洗涤过程。
贾鹏飞[4]（2010）在《激光共聚焦和双光子显微镜对细胞的成像及植物细胞Cytomixis的研究》文中研究说明近十年来,由于生物荧光成像技术和荧光探针技术的飞速发展,以及生物活体组织和细胞的三维成像在生命科学研究中的重要意义,目前,激光共聚焦扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microcopy,简称CLSM）是生物细胞和组织的三维成像最有效的设备,已经普遍的在各个实验室广泛应用。但由于一些因素的制约,成像效果还没有达到非常理想的目标。近年来,光学显微镜技术中的一个最引人注目的成就是双光子激发现象（Two Photon Excitation,简称TPE）在激光共聚焦扫描显微镜中的广泛应用。双光子技术可以使我们无需使用紫外光源就能达到检测紫外荧光探针的目的。双光子激光高度的三维空间分辨性（激发在很小的三次方空间内）和大的穿透深度使双光子荧光成像技术迅速在生物细胞和组织（尤其是植物细胞组织）的活体三维成像研究方面获得了广泛的应用。同样,利用双光子激光扫描显微镜对活体细胞成像也存在一个关键问题：那就是目前缺乏有效的双光子荧光探针,因而利用传统荧光探针,双光子激光扫描显微镜也很难使不透明的、较厚的活体组织在较深的层面上进行清晰的荧光成像,目前国际上在活体植物不透明组织中成像研究中的最好记录是60-70nm,这也是当前生物学界对激光扫描共聚焦显微镜和双光子激光扫描显微镜在应用中存在争论的焦点所在。因此,缺乏大吸收截面的荧光探针分子严重制约了双光子激光扫描显微镜的广泛应用。本文首先通过利用各种传统的荧光探针和激光共聚焦显微镜以及双光子激光扫描显微镜,对各种细胞及细胞内的成分进行成像研究,从而对激光共聚焦显微镜及双光子激光扫描显微镜细胞成像的技术有一个深入的研究和总结。其次,通过研究双光子荧光探针的特性,我们合成并表征了几个具有高灵敏度、高双光子吸收截面的双光子核酸荧光探针,BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC,同时利用这些探针对细胞核的双光子成像进行了系统的研究,为生命科学工作者们提供了几个细胞膜半通透性的、真正意义上的双光子核酸荧光探针。第三,通过利用高效荧光探针和激光共聚焦显微镜以及双光子激光扫描显微镜对活体植物细胞融合现象进行三维动态成像研究,为从根本上解决细胞融合现象研究中的争论,以及细胞融合的发生机理研究,建立了一个崭新的研究体系和平台。
杨华艳[5]（2007）在《用原子力显微镜测量Mac-1和ICAM-1单分子相互作用力》文中研究说明Mac-1属于β2整合素家族,是位于白细胞表面的参与机体防御作用及免疫反应极为重要的粘附分子,在神经系统的小胶质细胞和巨噬细胞上也有表达,参与脱髓鞘病变过程中的髓鞘吞噬。ICAM-1属于免疫球蛋白超家族,位于血管内皮细胞上,是Mac-1的主要配体。两者的相互作用在白细胞与内皮细胞的牢固粘附中起非常重要的作用。Mac-1有一个重要的特点那就是对配体的粘附能力是受动态调节的,只有受到刺激被激活时才会对它的各种配体表现出高的粘附能力。然而到目前为止对于Mac-1活化后究竟是怎样导致对配体粘附能力增高的,其本质到底如何还没有相关研究。本课题利用原子力显微镜对Mac-1和其配体ICAM-1间的相互作用进行了直接的测量,结果显示Mac-1被活化后,与ICAM-1的结合几率增高,结合力增大。通过比较ICAM-1与活化的Mac-1及不同Mac-1突变体之间的动力学力谱,我们推测I结构域α7螺旋的下移是Mac-1活化的关键步骤。
杨生生,杨志峰,严鸣,蔡在龙,焦炳华,毛积芳[6]（2006）在《应用Tet-On基因表达系统实现Mac-1-FP在CHO细胞中的可调控性表达》文中认为目的:应用Tet-On基因表达系统构建可调控性真核表达质粒,实现Mac-1-FP在CHO细胞中的可调控性表达。方法:采用DNA重组技术构建真核表达质粒pTRE-Tight-CFP-CD11b和pTRE-Tight-YFP-CD18（CD11b和CD18是Mac-1的两个亚基）,通过脂质体介导共转染CHO细胞,用荧光显微镜观察转染后阳性细胞;应用RT-PCR和荧光强度分析观察不同浓度（0、0.01、0.1、0.5、1、2μg/ml）强力霉素（Dox）对细胞内CD11b和CD18表达水平的影响;检测PMA（1μg/ml）刺激前后CHO-Mac-1-FP细胞与其配基ICAM-1黏附活性的变化。结果:酶切鉴定和测序证实,已成功构建真核表达质粒pTRE-Tight-CFP-CD11b和pTRE-Tight-YFP-CD18,在荧光显微镜下观察到转染成功的CHO细胞发出青色荧光和黄色荧光。通过荧光显微镜观察到随着培养液中Dox浓度的增加,CHO细胞内的荧光强度相应增强,同时CD11b和CD18在mRNA水平的表达也随Dox浓度的增加而增加。PMA刺激后,CHO-Mac-1-FP细胞与其配基ICAM-1黏附率增高（2 h和4 h时最高,此后逐渐下降）。结论:本研究成功实现了Mac-1-FP在CHO细胞中的可调控性表达并具有野生型Mac-1的黏附活性,为进一步开展单分子光谱（SMS）和荧光共振能量转移（FRET）技术研究活细胞内Mac-1分子的2个亚基的二聚化、群集、构象及与配基亲和力变化创造条件。
杨生生[7]（2005）在《Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的可调控性表达、鉴定和FRET技术对其相互作用的检测》文中研究表明白细胞粘附分子Mac-1（macrophage differentiation antigen associated with complement three receptor function）为位于白细胞表面的整合素家族β2亚族的成员之一,它是白细胞表面参与机体防御功能及免疫反应的极为重要的粘附分子。它由α（CD11b）和β（CD18）两个亚基以非共价键的方式形成异二聚体,编码CD11b和CD18的基因分别位于人的第16号和第21号染色体。Mac-1具有两种主要功能:一是与活化的内皮细胞表面的ICAM-1高亲和力的粘附,进而介导白细胞的游走与渗出;二是介导白细胞对iC3b调理的微生物或免疫复合物的细胞毒功能。 迄今为止,Mac-1粘附功能的研究已经相当深入,但由于方法学的限制,对于Mac-1的分布、贮存、转位和变构的过程,尚未见有活细胞内对其全过程动态实时的定位定量的研究。以往文献上研究Mac-1的分布、贮存、转位的方法,主要采用的是抗体标记Mac-1的流式细胞术测定或免疫组化技术显微镜下直接观察Mac-1的细胞内分布,其缺点是不可能在单细胞和/或活细胞连续地观察,如果要研究在细胞内的走向则还需要增大细胞表面通透性,这就难免干扰了细胞的生理状态。并且集团平均（ensemble averaging）研究所探测的是细胞内大量分子的综合平均效应,得到的是由大量对象组成的一个整体所表现出的平均响应和平均值,因此从这些实验所得出的结果只代表这一测量时间内细胞内大量分子的平均行为,这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。GFP（绿色荧光蛋白）及其突变体BFP（蓝色荧光蛋白）、CFP（青色荧光蛋白）、YFP（黄色荧光蛋白）具有发光不需要底物、稳定、无毒性、分子量小、形成融合蛋白后不致影响自身和目的基因产物的空间构象和功能等优点,已成为研究蛋白质分子在活细胞内变化的主要标记物。近年来,结合荧光蛋白技术的荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）技术已逐渐运用于活细胞内蛋白质之间相互作用的研究。FRET的发生取决于供体荧光和受体荧光的性
严鸣,毛积芳,钟纪根,何健,朱秋峰,徐仁宝[8]（2003）在《YFP-CD18融合蛋白在U937细胞株中的表达与鉴定》文中认为目的 :构建并表达Mac - 1的β链CD18与黄色荧光蛋白 （YFP）的融合蛋白YFP -CD18,为进一步直视研究Mac- 1在白细胞内的分布、走向及归宿提供物质条件。方法 :首先将CD18的全长cDNA与pEYFP -C1进行酶切 ,构建YFP与CD18的N末端连接的表达载体 ,并将其转染至U937细胞株中进行表达。通过荧光显微镜观察转染成功后的U937细胞黄色荧光是否存在 ,以及流式细胞术检测确定PMA刺激后YFP -CD18活化后可否由胞浆内转位至膜上和测定PMA活化前后转染的U937细胞与其配基ICAM - 1粘附活性的变化等方面来进行鉴定。结果 :经酶切鉴定 ,pYFP -CD18构建正确 ,转染U937细胞株后 ,可见YFP -CD18融合蛋白发出的黄色荧光。结论 :构建完成YFP -CD18融合基因并可以在U937细胞株中进行表达。
刁飞[9]（2003）在《Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的表达与鉴定及CHO细胞对PMA反应的某些特点》文中进行了进一步梳理Mac-1（CD11b/CD18）是位于白细胞表面参与机体防御功能及免疫反应的重要粘附分子。它由α（CD11b）和β（CD18）两个亚基以非共价键的方式缔合成异二聚体；编码CD11b和CD18的基因在人分别位于第16号和第21号染色体上。Mac-1具有两种主要功能：一是与活化的内皮细胞表面上的ICAM-1高亲和力的粘附，介导白细胞的游走与渗出。二是介导白细胞对iC3b调理的微生物或免疫复合物的细胞毒功能。 迄今为止，Mac-1粘附功能的研究已经相当深入，但对于Mac-1的分布、贮存、转位和变构的过程，虽然文献报告很多，但由于方法学的限制，尚未见有在一个活细胞内对其全过程进行动态实时的定位定量的研究。以往文献中研究Mac-1的分布、贮存、转位的方法，主要采用的是抗体标记Mac-1，用流式细胞术测定或免疫组化技术显微镜下直接观察Mac-1的细胞内分布，但其缺点是不可能在单细胞、活细胞连续地观察，如果要研究在细胞内的走向则还需要增大细胞表面通透性，这就难免干扰了细胞的生理状态。作为一种标记物，GFP（绿色荧光蛋白）具有发光不需要底物、稳定、无毒性、分子量小、形成融合蛋白后不致影响自身和目的基因产物的空间构象和功能等优点，因此，利用GFP及其突变体BFP（蓝色荧光蛋白）、CFP（青色荧光蛋白）、YFP（黄色荧光蛋白）等作为标记物则是研究蛋白质分子在活细胞内变化的较为理想的方法。本研究组决定采用GFP标记Mac-1形成融合蛋白的方法，研究Mac-1在活细胞内的定位、走向及其功能。 在本研究组以前的工作中，严鸣等曾利用GFP的突变体BFP与YFP分别标记CD11b的C末端和CD18的N末端构建成功pCD11b-BFP、pYFP-CD18融合蛋白表达质粒。为了应用FRET进行研究的需要，本文更换荧光载体，用CFP替代BFP成功构建了pCD11b-CFP表达质粒。将pCD11b-CFP和pYFP-CD18稳定转染到无内源性Mac-1表达的CHO细胞，我们在荧光显微镜下观察到转染成功的CHO细胞发出青色荧光和黄色荧光，并得到稳定表达两种不同荧光蛋白的CHO细胞（CHO-Mac-1-FP细胞），应用Western blot我们验证了CHO-Mac-1-FP细胞能够表弟工车由人学硕士金交 申支构要达CDllb－CFP和 YFP－CD18融合蛋白，通过测定PMA活化前后 CHO－Mao－IFP细胞与其配基ICAM－l粘附活性的增强则提示：CDI fo－CFP与YFP－CD18融合蛋白能够像野生型＊ l一样形成二聚体，并能转位到细胞膜上发挥粘附功能。从而为下一步应用FRET方法研究CDllb(FP与WP七 融合蛋白二聚化的部位和动态过程（二聚化的速度和解聚的过程等）以及Mao－l的功能研究奠定了必要的基础。在此基础上，我们还通过激光共聚焦显微镜观察到 CDllbCFP和 YFPC 融合蛋白在细胞内的不同分布。 为了排除内源性Maoq的影响，我们选用CHO细胞作为转染靶细胞，但CHO细胞来源于卵巢的成纤维细胞，属于非专职性炎细胞。迄今为止，文献上对于各种来源的成纤维细胞的炎症反应性的报告已有很多，但尚未见有关于CHO细胞炎症反应特点的报告。为了应用 Mao上IPCHO细胞研究Maoq的功能，我们必须对野生型CHO细胞生成炎症介质的特点有个基本的了解。本文以RAW264．7细胞作为阳性对照，观察了 PMA刺激后 CHO细胞的NO生成、Oz”和 TNF心的变化，发现CHO细胞的 OZ”禾 TNF－a没有变化，NO生成少量增加，但增加幅度低 于RAW264．7细胞。这些结果提示：我们所用的CHO细胞缺乏某些与炎症介质生成相关的信号转导通路。
严鸣,毛积芳,钟纪根,何建,朱秋峰,娄淑杰,徐仁宝[10]（2003）在《CD11b-BFP融合蛋白在U937细胞株中的表达与鉴定》文中研究说明目的 :构建并表达巨噬细胞分化抗原 1（Mac- 1）的 α链 CD11b与蓝色荧光蛋白 （BFP）的融合蛋白 CD11b- BFP,为进一步直视研究 Mac- 1在白细胞内的分布、走向及归宿提供物质条件。方法 :首先将 CD11b的全长 c DNA进行酶切并获得 2个片段 ,将其中含有终止密码的片段作为模板 ,通过设计引物进行 PCR,获得不含有终止密码的该片段 ,然后与另一片段进行连接 ,形成不含有终止密码的 Mac- 1全长 c DNA,将其插入到表达载体 p EBFP- N1中 ,构建完成 CD11b- BFP融合基因 ,最后将其转染至 U937细胞株中 ,通过荧光显微镜观察与流式细胞术检测 Mac- 1的表达及其黏附活性来进行鉴定。 结果 :经酶切鉴定 ,p CD11b- BFP构建完全正确 ,转染 U937细胞株后 ,可见 CD11b- BFP融合蛋白发出的蓝色荧光。 结论 :构建完成 CD11b-BFP融合基因并在 U937细胞株中进行表达
二、Expression and characterization of Mac-1-FP fusion protein in CHO cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Expression and characterization of Mac-1-FP fusion protein in CHO cells（论文提纲范文）
（1）新型pH敏感红色荧光蛋白及其在囊泡分泌中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 红色荧光蛋白的发展 |
| 1.1.1 红色荧光蛋白的结构与发光原理 |
| 1.1.2 红色荧光蛋白的性质及改造 |
| 1.2 pH敏感型荧光蛋白 |
| 1.2.1 pH敏感型荧光蛋白的种类及特性 |
| 1.2.2 pH敏感型荧光蛋白的应用 |
| 1.3 囊泡转运和细胞分泌 |
| 1.3.1 囊泡转运过程 |
| 1.3.2 囊泡上几种重要蛋白 |
| 1.3.3 囊泡分泌 |
| 1.3.4 待解决问题 |
| 1.4 本研究的内容和意义 |
| 第2章 实验原理和方法 |
| 2.1 TIRF成像技术 |
| 2.2 SIM成像技术 |
| 2.3 荧光蛋白探针定向进化的方法 |
| 第3章 pH敏感型红色荧光蛋白的改造 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 质粒构建 |
| 3.2.2 突变体的产生和筛选 |
| 3.2.3 蛋白表达与纯化 |
| 3.2.4 pKa和n_H的测定 |
| 3.2.5 单体性测定 |
| 3.2.6 光物理和光化学性质测定 |
| 3.2.7 细胞培养,转染,滴片 |
| 3.2.8 共聚焦成像 |
| 3.2.9 光开关性质的测量 |
| 3.2.10 数据处理 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 pH敏感红色荧光蛋白pHmScarlet的产生 |
| 3.3.2 pHmScarlet的光物理和光化学性质 |
| 3.3.3 pHmScarlet的单体性质 |
| 3.3.4 pHmScarlet在细胞内的亮度与稳定性 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 囊泡分泌的检测 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料和实验方法 |
| 4.2.1 质粒构建 |
| 4.2.2 细胞培养,转染,滴片 |
| 4.2.3 TIRF活细胞成像实验 |
| 4.2.4 SIM活成像实验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 使用VAMP2-pHmScarlet检测INS-1细胞中单个囊泡分泌事件 |
| 4.3.2 使用VAMP2-pHmScarlet检测神经细胞中突触小泡分泌事件 |
| 4.3.3 pHmScarlet标记能检测到囊泡锚定过程 |
| 4.3.4 使用pHmScarlet和SEP对不同囊膜货物的胞吐作用进行双色成像 |
| 4.3.5 使用pHmScarlet标记对扩大的融合孔进行Hessian-SIM超分辨率成像 |
| 4.4 讨论 |
| 常用缩略词对照表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（2）重组活化凝血因子Ⅶ药物的临床应用和研发现状（论文提纲范文）
| 1重组活化凝血因子Ⅶ的药理特性 |
| 1.1分子结构 |
| 1.2凝血机制 |
| 1.3药效学特性 |
| 2重组活化凝血因子Ⅶ的临床应用 |
| 2.1在含有抑制剂的血友病中的应用 |
| 2.2在获得性血友病中的应用 |
| 2.3在其他罕见出血性疾病中的应用 |
| 2.4在非凝血疾病出血中的应用 |
| 3重组活化凝血因子Ⅶ的研究现状 |
| 3.1化学修饰的重组活化凝血因子Ⅶ |
| 3.2融合蛋白类的重组活化凝血因子Ⅶ |
| 3.2.1 r FⅦa‐HSA融合蛋白 |
| 3.2.2 r FⅦa‐Fc融合蛋白 |
| 3.2.3 r FⅦa‐CTP融合蛋白 |
| 4问题与展望 |
（3）SNAP-tag荧光探针与细胞内蛋白标记应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 基于环境敏感与淬灭机制的SNAP-tag探针及其细胞内蛋白的标记 |
| 第一部分 荧光探针的合成 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 第二部分 SNAP-tag蛋白的表达、纯化与表征 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 溶液配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 含有目的基因的pET-22b载体的构建 |
| 2.2 SNAP-tag蛋白的表达 |
| 2.3 SNAP-tag蛋白的纯化[42] |
| 2.4 SNAP-tag蛋白的表征 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 含有目的基因的pET-22b载体的构建 |
| 3.2 SNAP-tag蛋白的表达、纯化和表征 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 SNAP-tag蛋白的体外标记与光谱测定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 BGAN-R与SNAP-tag蛋白标记前后荧光光谱测定 |
| 2.2 荧光探针BGAN-R的溶剂化效应及量子产率测定 |
| 2.3 由BGAN-R标记的SNAP-tag蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.4 BGAN-R标记的SNAP-tag蛋白的动力学研究 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 BGAN-R与SNAP-tag蛋白标记前后荧光光谱测定 |
| 3.2 荧光探针BGAN-R的溶剂化效应及量子产率测定 |
| 3.3 由BGAN-R标记的SNAP-tag蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.4 BGAN-R标记的SNAP-tag蛋白的动力学研究 |
| 4. 讨论 |
| 第四部分 荧光标记的SNAP-tag蛋白在生物学方面的应用 |
| 1. 材料 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 MTT法测定细胞活力 |
| 2.2 细胞成像 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 MTT法测定细胞活力 |
| 3.2 细胞成像 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 光诱导电子转移型SNAP-tag探针与细胞内铜离子的检测 |
| 第一部分 荧光探针的合成 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 第二部分 SNAP-tag蛋白的表达、纯化与表征 |
| 第三部分 SNAP-tag蛋白的体外标记与光谱测定 |
| 1. 材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 BGAN-DPA与SNAP-tag蛋白标记前后荧光光谱测定 |
| 2.2 BGAN-DPA与SNAP-tag蛋白标记前后的量子产率测定 |
| 2.3 BGAN-DPA标记的SNAP-tag蛋白的动力学研究 |
| 2.4 由BGAN-DPA标记的SNAP-tag对金属离子及阴离子的检测 |
| 2.5 由BGAN-DPA标记的SNAP-tag的铜离子滴定实验 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 BGAN-DPA与SNAP-tag蛋白标记前后荧光光谱测定 |
| 3.2 BGAN-DPA与SNAP-tag蛋白标记前后的量子产率测定 |
| 3.3 BGAN-DPA标记的SNAP-tag蛋白的动力学研究 |
| 3.4 由BGAN-DPA标记的SNAP-tag对金属离子及阴离子的检测 |
| 3.5 由BGAN-DPA标记的SNAP-tag的铜离子滴定实验 |
| 4. 讨论 |
| 第四部分 荧光标记的SNAP-tag蛋白在生物学方面的应用 |
| 1. 材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 MTT法测定细胞活力 |
| 2.2 细胞成像 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 MTT法测定细胞活力 |
| 3.2 细胞实验 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 SNAP-tag荧光探针用于免洗蛋白标记的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录（化合物的核磁谱图） |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（4）激光共聚焦和双光子显微镜对细胞的成像及植物细胞Cytomixis的研究（论文提纲范文）
| Abbreviations |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 一、激光共聚焦扫描显微镜研究进展 |
| 1、激光共聚焦扫描显微镜的介绍 |
| 2、激光共聚焦扫描显微镜成像的原理 |
| 3、传统光学显微镜的不足 |
| 4、激光共聚焦扫描显微镜的组成 |
| 5、激光共聚焦扫描显微镜的一些重要参数选择 |
| 6、激光共聚焦扫描显微镜的优越性和研究领域 |
| 7、激光共聚焦显微镜在生物学上的应用 |
| 8、激光共聚焦扫描显微镜荧光探针的选择和应用 |
| 9、绿色荧光蛋白 |
| 二、双光子激光扫描显微镜研究进展 |
| 1、双光子激光扫描显微镜简介 |
| 2、激光共聚焦显微镜和双光子激光扫描显微镜的简单比较 |
| 3、双光子吸收机制 |
| 4、荧光材料的双光子吸收截面σ |
| 5、双光子激光器 |
| 6、双光子荧光探针 |
| 三、植物细胞Cytomixis的研究进展 |
| 1、植物细胞Cytomixis的简介 |
| 2、植物细胞Cytomixis的发生过程 |
| 3、植物细胞Cytomixis的结果和意义 |
| 四、本课题研究的目的和意义 |
| 1、激光共聚焦和双光子激光扫描显微镜对细胞成像研究的目的和意义 |
| 2、植物细胞Cytomixis研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 一、实验材料 |
| 1、动物细胞 |
| 2、植物材料 |
| 3、质粒 |
| 4、菌株 |
| 5、主要试剂 |
| 6、荧光染料 |
| 二、实验方法 |
| 1、HepG2、Chang Liver细胞的培养 |
| 2、Hela细胞的培养 |
| 3、DiO及DiI标记HepG2和Chang Liver细胞 |
| 4、MVEC、BMVEC和2,7-BHVC标记Hela细胞 |
| 5、PI、DAPI、MVEC、BMVEC和2,7-BHVC等对烟草和拟南芥染色 |
| 6、激光共聚焦显微镜观察共培养的HepG2及Chang Liver细胞 |
| 7、对MVEC、BMVEC和2,7-BHVC标记Hela细胞用双光子激光扫描显微镜成像 |
| 8、PI、DAPI、MVEC、BMVEC和2,7-BHVC等标记的烟草和拟南芥用激光共聚焦和双光子激光扫描显微镜成 |
| 9、拟南芥菜无菌培养 |
| 10、转化植株的荧光鉴定 |
| 11、杂交获得双转化植株 |
| 12、阿勃缺体小麦花粉母细胞中Cytomixis的分析 |
| 13、转基因烟草(H2B-CFP)细胞中Cytomixis的活体成像 |
| 第三章、实验结果 |
| 一、双光子核酸荧光探针BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC的设计合成、光学性能表征和荧光成像 |
| 1、BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC的设计、合成 |
| 2、BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC的光学性能表征 |
| 3、BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC的荧光成像研究 |
| 二、利用激光共聚焦和双光子激光扫描显微镜,对各种荧光探针和荧光蛋白标记的动植物细胞和组织的成像结果 |
| 1、对HepG2及Chang Liver细胞之间的纳米管通道的成像 |
| 2、动物细胞各组分多探针标记,激光共聚焦和双光子激光扫描显微镜多通道扫描成像结果 |
| 3、PI对植物不同组织的染色结果 |
| 4、DAPI对植物细胞核的染色结果 |
| 5、植物细胞活体有丝分裂的双光子激光扫描显微镜成像 |
| 6、转基因拟南芥叶片组织中GFP的激光共聚焦扫描显微镜成像 |
| 三、单转基因(H2B-CFP)拟南芥植株的荧光鉴定结果 |
| 四、植物细胞Cytomixis的实验结果 |
| 1、阿勃小麦缺体系中花粉母细胞细胞融合(Cytomixis)的分析结果 |
| 2、转基因烟草(H2B-CFP)幼苗细胞中Cytomixis的活体成像结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 第六章 图版 |
| 参考文献 |
| 博士期间所取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）用原子力显微镜测量Mac-1和ICAM-1单分子相互作用力（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| Ⅰ英文缩写 |
| Ⅱ中英文摘要 |
| Ⅲ前言 |
| Ⅳ材料和方法 |
| 1. 实验仪器 |
| 2. 实验材料 |
| 3. 实验方法 |
| Ⅴ结果 |
| 一、Mac-1 荧光融合蛋白表达质粒及α亚基突变体的构建 |
| 二、Mac-1 荧光融合蛋白的功能鉴定 |
| 三、原子力显微镜测量Mac-1 和ICAM-1 的单分子相互作用力 |
| Ⅵ讨论和结论 |
| Ⅶ参考文献 |
| Ⅷ综述 |
| Ⅸ致谢 |
（7）Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的可调控性表达、鉴定和FRET技术对其相互作用的检测（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的可调控性表达与鉴定 |
| 一、Mac-1-FP可调控真核表达质粒的构建 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 二、Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的可调控表达 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 三、Mac-1-FP融合蛋白的功能鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 应用FRET技术检测CHO细胞内Mac-1-FP的相互作用 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
（8）YFP-CD18融合蛋白在U937细胞株中的表达与鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验材料: |
| 1.1.2 实验仪器: |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 pYFP-CD18基因克隆构建: |
| 1.2.2 融合蛋白YFP-CD18在真核细胞株U937中的表达: |
| 1.2.3 荧光成像系统观测: |
| 1.2.4 流式细胞术测定Mac-1-FP: |
| 1.2.5 粘附活性的测定: |
| 2 结果 |
| 2.1 pYFP-CD18真核表达载体的构建 |
| 2.2 融合蛋白YFP-CD18在真核细胞株U937中的表达与鉴定 |
| 3 讨论 |
（9）Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的表达与鉴定及CHO细胞对PMA反应的某些特点（论文提纲范文）
| 英文缩写 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的表达与鉴定 |
| 一、 pCD11b-CFP融合蛋白表达质粒的构建 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 二、 Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 三、 Mac-1-FP融合蛋白的功能鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 四、 CHO-Mac-1-FP细胞的初步应用 |
| 材料与方法 |
| 结果与讨论 |
| 第二部分 CHO细胞对PMA反应的某些特点 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述1: Mac-1的结构与功能 |
| 综述2: 荧光共振能量转移(FRET)在蛋白质研究中的应用 |
四、Expression and characterization of Mac-1-FP fusion protein in CHO cells（论文参考文献）
- [1]新型pH敏感红色荧光蛋白及其在囊泡分泌中的应用[D]. 刘安远. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [2]重组活化凝血因子Ⅶ药物的临床应用和研发现状[J]. 刘雨璐,朱晓霞,顾若兰,甘慧,窦桂芳,孟志云. 军事医学, 2021(02)
- [3]SNAP-tag荧光探针与细胞内蛋白标记应用研究[D]. 冷双. 大连医科大学, 2017(08)
- [4]激光共聚焦和双光子显微镜对细胞的成像及植物细胞Cytomixis的研究[D]. 贾鹏飞. 兰州大学, 2010(10)
- [5]用原子力显微镜测量Mac-1和ICAM-1单分子相互作用力[D]. 杨华艳. 第二军医大学, 2007(03)
- [6]应用Tet-On基因表达系统实现Mac-1-FP在CHO细胞中的可调控性表达[J]. 杨生生,杨志峰,严鸣,蔡在龙,焦炳华,毛积芳. 第二军医大学学报, 2006(10)
- [7]Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的可调控性表达、鉴定和FRET技术对其相互作用的检测[D]. 杨生生. 第二军医大学, 2005(07)
- [8]YFP-CD18融合蛋白在U937细胞株中的表达与鉴定[J]. 严鸣,毛积芳,钟纪根,何健,朱秋峰,徐仁宝. 生物技术, 2003(04)
- [9]Mac-1-FP融合蛋白在CHO细胞中的表达与鉴定及CHO细胞对PMA反应的某些特点[D]. 刁飞. 第二军医大学, 2003(04)
- [10]CD11b-BFP融合蛋白在U937细胞株中的表达与鉴定[J]. 严鸣,毛积芳,钟纪根,何建,朱秋峰,娄淑杰,徐仁宝. 第二军医大学学报, 2003(02)
标签：荧光探针论文; 融合蛋白论文; 荧光共振能量转移论文; 荧光蛋白论文; 科学论文;