一、外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定（论文文献综述）
李兰洲[1]（2021）在《基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究》文中研究指明胸腺肽类药物在恶性肿瘤的临床治疗常作为免疫调节剂与化疗药物联合使用。临床数据显示,胸腺肽类药物的使用提升了恶性肿瘤患者存活率和生活质量。胸腺肽注射制剂在使用中容易引起严重的过敏等副作用,而胸腺肽肠溶片虽然安全性更高,但也存在药品标准简单,质量控制项少等问题,且其相关研究较少,临床定位模糊,作用机制不明确。本研究以胸腺肽肠溶片原料药小牛胸腺肽（CTP）作为研究对象,对其物质基础进行测定,并通过免疫低下小鼠模型,B6/JGpt-Apcem1Cin（Min C）/Gpt基因型（APC）原发性结直肠癌小鼠模型,造血体外细胞模型和造血功能障碍小鼠模型,对CTP的免疫调节活性,基于免疫调节活性的抗结直肠癌活性和促造血活性及其作用机制进行研究。首先测定了CTP的分子量及分子量范围,17种氨基酸及5种核苷酸含量。结果显示CTP中分子量在100-800道尔顿（Da）之间有69.15%的组分,CTP的数均分子量为222 Da,重均分子量为998 Da。同时发现CTP中既含有大量的必须氨基酸,如:60.24 g/kg的赖氨酸和49.46 g/kg的亮氨酸,又含有大量的非必需氨基酸,如:86.82 g/kg的谷氨酸和55.67 g/kg的天冬氨酸。5种核苷酸中CMP以49763.19 mg/kg的含量占据绝对优势地位。其次,通过75 mg/kg环磷酰胺（CTX）建立免疫低下小鼠模型,通过测定小鼠自然杀伤（NK）细胞杀伤活性,淋巴细胞转化活性,免疫球蛋白（Ig）及细胞因子含量,对CTP免疫调节活性进行研究。结果显示CTP有效地缓解了免疫低下小鼠体重的降低,提高了小鼠NK细胞杀伤活性和淋巴细胞转化活性,提高了Ig A,Ig G,Ig M,白细胞介素（IL）-2,IL-6,肿瘤坏死因子α（TNF-α）,干扰素（IFN）-α和IFN-γ的含量,并降低了IL-10的含量。再次,在APC小鼠模型中,通过比较肿瘤形态变化及组织病理学,流式细胞术,肠道菌群测定,ELISA测定及western blot分析等技术,对CTP基于免疫调节的抗结直肠癌活性及作用机制进行研究。结果显示CTP作用有效地抑制了APC小鼠结直肠肿瘤的发展,限制了肿瘤组织中血管网络的建立,并有力地保持肠道细胞正常形态,说明在APC小鼠体内,CTP确实发挥了抑制结直肠癌的作用。CTP提高了APC小鼠外周血中NK细胞（CD3e-NK1.1+）和活化T淋巴细胞（CD3e+CD28+）的数量,提高了小鼠脾脏和肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞数量和辅助性T细胞（T helper cells,Th）1/Th2细胞比例。此外CTP作用显着提高了IL-2,IL-12,Toll样受体（TLR）4,TLR5含量,降低了IL-4,IL-10,转化生长因子β（TGF-β）含量,有效地提升了APC小鼠肠道菌群物种组成数量、种群丰度及均匀度,有效地降低了APC小鼠肿瘤及脾脏组织中细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）,程序性细胞死亡蛋白1（PD1）和程序性细胞死亡蛋白配体（PD-L）1含量,升高了小鼠脾脏中IL-2含量及Calcineurin A/活化T细胞核因子1（NFAT1）通路蛋白和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子κB抑制剂激酶（IKK）/核因子κB（NF-κB）p65通路蛋白的活化水平。最后选用K562细胞和CHRF细胞作为体外模型,通过XTT测定,流式细胞术凋亡测定,联苯胺染色,western blot分析等,在体外模型中初步确定CTP促造血活性。并通过100 mg/kg CTX建立造血功能障碍小鼠模型,模拟化疗引起的骨髓损伤相关的造血功能障碍。通过外周血细胞分析,组织病理学分析,骨髓细胞流式细胞术分析,蛋白质组学联合ELISA测定技术对造血相关细胞因子进行分析,western blot分析等,在体内水平对CTP促造血活性及作用机制进行研究。体外细胞实验显示,CTP作用在增强K562细胞和CHRF细胞增殖活性的同时,也促进了细胞分化,增加了K562和CHRF细胞中磷酸化（P）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2、P-核糖体蛋白S6激酶（RSK）1 p90、c-Myc和ETS转录因子ELK1（ELK1）等增殖分化相关蛋白的表达,证实CTP可通过调节增殖分化实现体外促造血作用。在造血功能障碍小鼠中,CTP促进了小鼠外周血中白细胞（WBC）,嗜酸性粒细胞（EO）,中性粒细胞（NE）等血细胞数量及血红蛋白含量的增多,并促进小鼠骨髓形态结构的重建及骨髓中B淋巴细胞,造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）的增多,同时增加了小鼠体内IL-2,IL-4,粒细胞集落刺激因子（G-CSF）,巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）等细胞因子水平,限制了IL-17,CCL1,单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）,TNF-α,IFN-γ等细胞因子的释放,显着升高了ERK1/2,PI3K,AKT和信号转导与转录激活因子3（STAT3）的磷酸化水平及G-CSF,粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）,M-CSF,NFAT1和IL-2的蛋白水平。以上结果表明:（1）CTP作为小分子多肽类物质,可以提高免疫低下小鼠体内免疫相关细胞因子水平,并提高了小鼠杀伤性免疫细胞的活性;（2）CTP通过调节肠道菌群,调控IL-2相关通路蛋白活化,降低免疫检查点作用,增加T淋巴细胞和NK细胞介导的免疫杀伤反应实现抗结直肠癌活性。（3）CTP能够通过调节G-CSF、M-CSF和IL-2水平及其相关通路蛋白变化,促进骨髓完整性重建和造血功能细胞增多,从而发挥促造血作用。本文研究内容将为CTP药物质量标准提升提供科学数据支持,并有助于确定CTP药物作用机制,明确其临床适用症,为基于CTP开发抗肿瘤或促造血药物提供科学的数据支持。
汤万波[2]（2021）在《Hlf标记的胚胎新生造血干细胞的功能及命运研究》文中研究说明造血干细胞是包括髓系细胞和淋系细胞在内的多种成熟血细胞的主要来源。小鼠胚胎发育过程中,造血干细胞主要起源于胚胎期第10.5天（embryonic day,E10.5）的主动脉-性腺-中肾区（aorta-gonad-mesonephros region,AGM）区,此时主动脉内皮经过内皮造血转化过程产生造血细胞。在该过程中,一小群特化的生血内皮细胞的形态逐渐由内皮细胞样的扁平转变为造血细胞样的圆形,并通过出芽的方式集结形成造血簇。簇中包含了造血干细胞前体,它们最终会发育为成熟造血干细胞并迁移至胎肝扩增,随后定植到骨髓。在胚胎造血干细胞发育过程中,由于缺乏特异性表面标志分子,一直无法精确捕获造血干细胞及其相关群体。我们前期研究筛选获得高特异性表面标志,结合单细胞诱导移植体系,首次在单细胞水平高效富集造血干细胞前体,并结合单细胞转录组测序,系统解析了造血干细胞发育全程的单细胞动态分子表达特征。本课题进一步挖掘造血干细胞发育全程的单细胞转录组数据,针对胚胎期早期内皮细胞、造血干细胞前体、胎肝和成体造血干细胞群体的单细胞分子表达特征进行分析,得到造血干细胞特化过程中表达上调的基因集合,从中筛选出从造血干细胞前体到造血干细胞阶段逐渐上调并显着高表达在造血干细胞中的Hlf基因（hepatic leukemia factor,Hlf）。新近研究显示Hlf分子特异性的表达在胎肝及成体造血干细胞中,提示Hlf分子亦可能特异性标记胚胎早期的造血干细胞前体和造血干细胞,为此我们构建了 Hlf-tdTomato荧光报告小鼠和Hlf-CrexER谱系示踪小鼠。我们针对新构建的Hlf-tdTomato荧光报告小鼠进行表达图谱的鉴定,组化染色结果显示:在E10.5 AGM区中共表达RUNX1和CD31的造血相关群体表达Hlf-tdTomato,而CD31+的内皮层细胞基本不表达Hlf-tdTomato。流式结果也表明,E10.5 AGM 区内皮细胞群体（CD31+CD41-CD43-CD45-）不表达 Hlf-tdTomato,造血簇（CD31+Kit+）中有超过40%的细胞表达Hlf-tdTomato;E11的AGM区中有接近40%的CD45-造血干细胞前体和几乎所有的CD45+造血干细胞前体都表达Hlf-tdTomato。我们进一步通过诱导移植实验发现:在E10.5的CD31+CD45+Kit+群体中,仅Hlf-tdTomato+亚群在诱导/移植后3到4周存在髓系和淋系重建,而CD31+CD45-Kit+群体中,Hlf-tdTomato+和 Hlf-tdTomato-亚群在移植后3到4周均出现髓系和淋系重建,表明Hlf表达能特异性富集功能性CD45+造血干细胞前体。此外,E11造血簇细胞（CD3 1+Kit+）进行体外孵育后的产物分析结果显示:只有Hlf+细胞能产生造血干细胞表型样的细胞。以上功能实验表明Hlf-tdTomato表达能进一步有效富集CD45+造血干细胞前体。继而,利用新构建Hlf-CrexER与ROSA26报告小鼠杂交,通过在早期胚胎发育的不同时间点进行诱导,对表达Hlf-CrexER的细胞群体进行谱系示踪,以探究早期胚胎Hlf-CrexER阳性细胞对胎肝各造血干祖细胞群体和成体外周血贡献的动力学变化。使用 Lin-Sca-1+Mac-1lowCD201+（LSM201）、CD45+CD201+CD48-CD150+（ESLAM）和 Lin-Sca-1+Kit+CD48.CD150+（LSKSLAM）的表面标志组合进行胎肝造血干细胞的分析,我们发现E8.5诱导后,胎肝造血干细胞基本未被标记上,而E9.5、E10.5、E11.5和E13.5诱导后,胎肝造血干细胞标记比例呈现逐步上升,尤其E9.5和E10.5诱导后,标记比例均值出现跃升。对诱导后出生的成年小鼠外周血各谱系标记比例的持续检测发现,E9.5诱导后外周血各谱系标记比例均值约2%,显着低于E10.5诱导后（约20%）,表明该时间段随着Hlf表达强度的逐渐上升,可能充分标记了 AGM区的造血干细胞前体及造血干细胞群体。因为AGM区造血干细胞前体及造血干细胞群体起源于内皮细胞,我们进一步通过Tie2-Dre与Hlf-CrexER进行交配得到组成型小鼠,再与ROSA26报告小鼠杂交,即可将Hlf标记更加特异性的限定在早期内皮细胞。通过胎肝造血干细胞检测,我们发现组成型小鼠在胎肝造血干细胞中的标记比例不如诱导型中E13.5中造血干细胞标记比例高,并且通过对出生后小鼠外周血各谱系示踪记录比较,发现组成型小鼠外周血各谱系标记比例也低于诱导型小鼠外周血各谱系的标记比例。总之,本研究通过单细胞转录组分析,筛选到在造血干细胞前体、胎肝造血干细胞和成体造血干细胞中特异性表达的Hlf分子,并构建了 Hlf-tdTomato荧光报告小鼠和Hlf-CrexER谱系示踪小鼠。通过荧光报告小鼠模型我们对胚胎早期造血干细胞前体进行了进一步标记分析,并利用谱系示踪模型揭示了不同发育时间点Hlf分子表达标记细胞的造血命运以及对胎肝造血干细胞贡献的动力学变化。并且构建的小鼠模型可与多种基因型小鼠联合使用,谱系示踪小鼠与Confetti小鼠的联合使用能对造血干细胞的起源异质性进行研究,利用荧光报告小鼠可以探究造血干细胞在骨髓微环境中的定位及其与其他分子间相互作用的机制,这对研究造血干细胞的起源及其应用具有重要的借鉴意义。
邓磊[3]（2020）在《造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究》文中提出背景:微嵌合是指个体内一小部分细胞或DNA来自于另一个体的现象。微嵌合与移植耐受、慢性GVHD、自身免疫病等免疫过程有关,研究造血干细胞微嵌合形成的过程及其对受者T细胞免疫功能的影响具有重要意义。树突状细胞（DCs）是最重要的抗原提呈细胞之一,是T细胞活化的桥梁。修饰后的工程化树突状细胞能够增强对T细胞的调节作用,Mo S2纳米薄片（MSNs）由于优异的物理和化学性质,已应用于生物成像探针、生物传感器、光热治疗剂、药物载体和组织工程支架等方面。利用其作为佐剂来修饰树突状细胞是一个非常吸引人的研究课题。机体内的抗肿瘤免疫反应主要通过激活T细胞来杀死肿瘤细胞。原发性皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）是最常见的皮肤淋巴瘤,晚期皮肤T细胞淋巴瘤的5年生存率仍不到25%。早期阻止皮肤T细胞淋巴瘤的进展,将避免疾病晚期的高死亡率。方法:1. 为了研究造血干细胞输注产生的微嵌合过程及其对受者免疫功能的影响,我们将G-CSF动员后的C57脾细胞输注给不接受预处理的CB6F1可形成微嵌合。通过多色流式技术标记小鼠不同细胞亚群及供受细胞H-2抗原的不同,我们可以比较不同细胞亚群微嵌合形成的异同。通过小动物活体成像系统及C57BL/6-Tg（Fluc+/-）小鼠我们可以在活体内完整观察供者细胞在受者体内分布及扩增形成微嵌合的过程。多色流式技术使我们进一步可以检测微嵌合形成过程中供受者T细胞活化的状态及骨髓干祖细胞扩增的情况。通过流式分选细胞然后进行RNA-Seq,我们可以掌握微嵌合前后受者T细胞RNA的表达情况。2.我们使用了分别为100-250纳米（S-MSNs）和400-500纳米（L-MSNs）的少层状Mo S2薄片（MSNs）来修饰DCs。骨髓培养的DCs暴露在不同剂量（0、8、16、32、64、128μg/ml）MSNs中48h后,检测其表面标志、细胞因子分泌。应用小动物活体成像系统体内追踪DCs的归巢,通过流式检测其对局部淋巴结T细胞的活化作用。3.我们在-2天于C57BL/6小鼠接种EG7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞,于0天经尾静脉输注G-CSF动员后Balb/c小鼠脾细胞。分别在第0天和第7天将共孵育的DCs注入小鼠右侧脚垫中,并在第7天和第14天取小鼠尾静脉血通过多色流式技术检测嵌合。在第14天通过流式和细胞计数检测外周血及腘窝淋巴结T细胞的增殖活化。于第7天、10天、14天用游标卡尺测量并计算小鼠肿瘤体积。结果:1. DCI-6E7组在输细胞后+1天供者细胞植入为1.76±0.49%,+4天供者细胞嵌合到达最高2±0.54%,在7-14天其嵌合波动于1.2-1.9%,未见明显下降。但是14-21天其嵌合迅速降至0.18%,而后持续下降。DCI-6E7组小鼠细胞输注后体重逐渐上升,小鼠饮食、毛色、体态均未见明显异常,外周血白细胞仅仅是轻微下降而后恢复,但是血小板和血红蛋白却无明显变化。DCI-6E7组受鼠在1-14天时T、B细胞及其他亚群仅形成低比例供者嵌合（1.1%～4.5%）;+14天各细胞亚群嵌合均开始快速下降,至+28天,流式细胞术仅检测到极少量供者嵌合。6×107组CD3+,CD11b+,B220+细胞比例仅有轻度变化,分别波动于31.1-47.8%,25.6%-36%,8.6%-24.3%。CD4/CD8波动于1.5-3.2,持续>1。DCI-6E7组荧光强度在0-12小时上下波动,于+1天减弱,而1-5天无明显变化,并于第5-7天升高,随后持续下降,供者细胞荧光信号6×107组主要集中于淋巴结和脾脏。DCI-6E7组供者来源活化T细胞在输注后4-7天有不同程度扩增,而后逐渐下降。受者来源T细胞活化相关标志则在细胞输注后7-21天有剧烈扩增,而后逐渐下降。输细胞后+10天相对于输细胞前受者CD4+细胞差异基因明显上调的基因数目多余下调的基因数目,受者CD8+细胞差异基因明显下调的基因数目多余上调的基因数目。他们参与多种生物学过程和细胞组分以及分子学功能,涉及调节多种信号通路（包括免疫与炎症反应、自身免疫性疾病、感染性疾病等）。其中有许多基因参与免疫与炎症反应,他们通过调节TH1/TH2、TH17细胞的分化或直接通过细胞间的粘附通路调节炎症反应。2. 所有剂量（0-128μg/ml）不同大小的MSNs均不影响DCs的活性。128μg/ml的S-MSNs和L-MSNs处理的DCs其CD40、CD80、CD86和CCR7的表达显着升高。IL-12p70的分泌保持不变,而IL-1β减少分泌,TNF-α的分泌在某种程度上与MSNs治疗的剂量有关。只有128μg/ml的L-MSNs处理的DCs显着观察到增加的IL-6。MSNs处理显着促进了个体局部淋巴结和血液循环中DCs的体内外运动和体内归巢能力。DCs归巢能力增强的原因细胞是因为受ROS升高调节的细胞骨架的重排。经MSNs修饰的DCs接种到小鼠中,CD4+和CD8+T细胞的增殖和活化更为明显（以CD107a、CD69和ICOS的高表达为特征）。MSNs的处理并没有影响LPS诱导的DC激活、归巢和T细胞启动。3. OVA和MSNs的细胞毒性并不高,OVA单独不能促进DCs的成熟,而和MSNs共培养可以促进DC成熟,其特征是CD40,CD80和CD86的升高,增强IL-6的分泌。外周血造血干细胞输注可以在肿瘤小鼠体内产生供者细胞微嵌合,随着时间的延长有下降的趋势。外周血造血干细胞输注可以刺激肿瘤小鼠外周血B细胞和T细胞的扩增。特别是刺激了CD4+细胞、CD8+细胞中CD107a、CD69、ICOS活化标志细胞的大量扩增。DCs免疫可以刺激小鼠局部淋巴结中B细胞和T细胞的扩增,Mo S2修饰后可以进一步放大这种效果。特别是刺激了CD4+细胞,CD8+细胞中CD107a、CD69、ICOS活化标志细胞的大量扩增。对小鼠进行OVA-DCs免疫治疗可以抑制小鼠肿瘤的生长,而加上Mo S2修饰的DCs可以进一步抑制小鼠肿瘤生长。单独输注外周血造血干细胞也可以抑制肿瘤的生长。联合外周血造血干细胞输注和Mo S2-OVA-DCs免疫对肿瘤细胞的抑制效果最好。结论:1.通过活体成像,我们观察到供者细胞在受者体内形成微嵌合的过程。造血干细胞输注形成微嵌合与传统大嵌合相比仅轻度降低血象、无GVHD,激活了受者T细胞,并且可以刺激受者骨髓造血干祖细胞的扩增,调节受者免疫功能与炎症反应。这些结果为研究微嵌合的形成及其在抗肿瘤、自身免疫性疾病及促造血中的作用提供了基础。2.在DC的工程化修饰中,在相对高剂量（128μg/ml）时,MSNs可以提高DCs的体外成熟和淋巴结归巢,并大幅度提高DCs的活化能力,引起更强的CD4+和CD8+T细胞免疫反应。此外,ROS诱导的细胞骨架排列参与了MSNs修饰的DCs运动能力的提高。作为第一个系统研究MSNs对DC修饰的工作,我们的发现为修饰DC提供了新的方法,同时为MSNs作为免疫调节佐剂提供了支持证据。3. 造血干细胞微嵌合和二硫化钼纳米薄片修饰的DCs均具有一定抑制肿瘤的作用,联合二者可以发挥更强的抑制肿瘤生长的作用。发挥这一作用的途径可能是通过激活受者外周血及局部淋巴结T细胞的活化和扩增。
李增政[4]（2020）在《补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选》文中指出背景:免疫力低下在祖国医学看来多属于肾阳虚的范畴,以温阳补肾固卫气的根本出发对治疗临床上免疫力低下的患者有较好的疗效,尤其是对白血病患者,可以减轻白血病患者因药物产生的副作用和免疫抑制。细胞免疫治疗是新兴的肿瘤治疗手段之一,其通过各种生物技术手段在体外对免疫活性细胞进行改造,扩增后再回输到患者体内,进而达到提高患者免疫力,同时抑制或杀死肿瘤细胞的目的。此外在现代医学治疗白血病中小分子抑制剂占了重要一席,尤其是酪氨酸酶抑制剂,自伊马替尼诞生以来大大改变了慢性粒细胞白血病的治疗方式。许多中药或有药用作用的植物药对白血病细胞具有一定的杀伤作用,尽管已经报道了很多有治疗效果的小分子,但诸多药物中存在的小分子对白血病细胞的作用我们仍然不清楚。前期的临床实践证明补阳中药方剂有助于提升肾阳虚患者免疫力和白血病预后的线索,但方剂中的主要活性成分和起重要作用的中药我们对此知之甚少。同时诸多药用植物在民间被用来抗肿瘤,但其中起抗肿瘤作用的活性分子我们也仍然不清楚。因此本课题围绕补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫细胞的调节及活性成分分析和新型小分子抗白血病细胞的筛选来开展。目的:（1）探索中药补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫系统的调节作用为临床用药提供基础研究数据。（2）通过对补肾回阳方中的主要活性成分单体解析使得对该方剂的认识更加深入。（3）筛选出药用植物中具有抗白血病细胞的新型天然小分子为后续工作打下基础。方法:（1）补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫细胞的调节作用:通过腹腔注射25mg/kg氢化可的松,建立肾阳虚小鼠模型,对照组每日腹腔注射等量生理盐水,各组连续给药10天后,检测肾阳虚模型组和对照组小鼠的一般体征、外周血象、以及T淋巴细胞亚群等指标。随后给予肾阳虚模型小鼠补肾回阳方0.25ml/天灌胃治疗,模型对照组和空白对照组用生理盐水灌胃,一天一次,连续给药15天。治疗结束后检测小鼠的一般体征、外周血的相关免疫细胞,和通过流式细胞术测定各组小鼠的外周血、骨髓和脾脏的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平;以及分离小鼠外周血单核细胞进行后期细胞因子诱导培养DC细胞,检测其体外扩增情况,最后进行数据统计分析。（2）补肾回阳方的活性成分法分析:将补肾回阳方的浓缩液和标准品进行高效液相色谱分析和液质色谱串联分析,通过对比标准品和数据库来探索补肾回阳方中的活性成分。（3）新型小分子抗白血病细胞作用的:将分离得到的新型小分子化合物进行CCK-8药敏实验,筛选对白血病细胞有抑制作用的小分子。结果:（1）补肾回阳方对肾阳虚型小鼠免疫细胞的调节作用:中药灌胃治疗后,与模型对照组相比补肾回阳组小鼠的体重增长明显;外周血中白细胞和淋巴细胞水平明显上升;外周血、骨髓和脾脏中的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平明显提高;经过补肾回阳方灌胃治疗的肾阳虚模型小鼠,由外周血分离单核细胞经体外细胞因子诱导培养的DC细胞,细胞数量也明显高于模型对照组。（2）补肾回阳方的活性成分分析:结合标准品和数据库分析得到补肾回阳方中含有甘草苷、淫羊藿苷、次乌头碱三种物质,此外还得到与淫羊藿成分:异槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿苷A、淫羊藿次苷D2;炙甘草成分:甘草素、芹糖甘草苷、甘草黄酮C、甘草次酸;干姜成分:6-姜烯酚、6-姜辣素;肉桂成分:桂皮醛分子式和分子量一致的11种物质。（3）YWF-10、YHL-14、YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7、DX-15小分子对THP-1、Jurkat、KG-1三种细胞均有抑制作用,其中YHL-14、YWF-08两种小分子对32D细胞的抑制作用没有统计学差异（P>0.05）,但对KG-1、THP-1的抑制作用有统计学差异（P<0.01）,并且YWF-08对Jurkat细胞也有较强的抑制作用（P<0.001）。YWF-10、YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7五种小分子对Jurkat细胞的抑制率远高于对其他细胞的抑制率;相比于对32D细胞的抑制率Jurkat细胞的抑制率也远大于对32D细胞的抑制率。结论:（1）补肾回阳方可以提升肾阳虚小鼠外周血中的白细胞和淋巴细胞数量,可以提高外周血、骨髓和脾脏中的CD3+、CD3-NK1.1+、CD3+NK1.1+的占比水平,以及可以提高DC细胞的体外诱导培养数量,证明补肾回阳方对肾阳虚小鼠具有增强和恢复免疫的功效。（2）补肾回阳方中含有甘草苷、淫羊藿苷、次乌头碱三种物质,此外含有与异槲皮素、淫羊藿次苷II、淫羊藿苷A、淫羊藿次苷D2、甘草素、芹糖甘草苷、甘草黄酮C、甘草次酸、6-姜烯酚、6-姜辣素、桂皮醛分子式和分子量一致的物质11种,其中淫羊藿和炙甘草的活性成分最多,鉴于前人的研究和本研究结果在补肾回阳方对免疫的正向调节作用中淫羊藿和炙甘草发挥了要作用。（3）YWF-08、XY-24、XY-1、DS-7五种小分子对Jurkat细胞的抑制率远高于对其他细胞的抑制率;其中YHL-14、YWF-08两种小分子对32D细胞没有抑制作用,但对KG-1细胞和THP-1细胞有较强的抑制作用。
吕萃[5]（2020）在《多能干细胞分化再生T细胞的体内抗肿瘤评估及再生可移植髓系细胞研究》文中提出从多能干细胞诱导分化出可移植、有功能的血液及免疫细胞一直是再生医学领域的研究热点和难点。本文第一部分证明小鼠胚胎干细胞分化来源、体内成熟的T细胞可以结合CAR-T技术改造实现体内清除肿瘤的目的,第二部分初步实现诱导小鼠胚胎干细胞获得可移植的髓系祖细胞种子,移植后可在体内短期再生髓系细胞（包括粒细胞、单核-巨噬细胞）。本研究为再生T细胞以及可移植髓系细胞的转化研究提供了技术借鉴。嵌合抗原受体 T 细胞（Chimeric Antigen Receptor T cells,CAR-T）疗法已成为临床上治疗血液肿瘤的有效手段。通常CAR-T细胞是通过分离患者外周血来源的T细胞在体外进行基因编辑而制备,但是患者自身的T细胞数量有限且经常出现功能异常或耗竭,因此需要探索T细胞新的来源。本研究基于课题组已开发的定向诱导T细胞技术,利用Runx1-Hoxa9条件性表达的多能干细胞系诱导分化出可植入免疫缺陷鼠（B-NDG）的造血祖细胞（induced hematopoietic progenitorcells,iHPCs）,移植B-NDG小鼠5周后,从脾脏中分离出再生的T细胞（induced T cells,iT）,通过将iT细胞感染CD19-CAR逆转录病毒制备CD19-CAR iT细胞。为了验证CD19-CAR iT细胞在体内针对B淋巴瘤细胞的杀伤功能,本研究首先通过移植表达荧光素酶（luciferase）的B淋巴瘤细胞（Ka539-luciferase）构建了基于C57BL/6的肿瘤负荷鼠模型,随后分别将CD19-CAR iT细胞和Ctrl-CARiT细胞（阴性对照）过继移植到肿瘤模型中,流式检测发现CD19-CAR iT细胞可以持久抑制外周血中CD19+B细胞的产生,这表明了其具有针对特异抗原的直接杀伤能力。同时小鼠活体成像实验证实CD19-CAR iT细胞可以有效缓解肿瘤模型鼠的肿瘤负荷,并且相比于对照组,经过CD19-CAR iT细胞治疗的肿瘤鼠能够显着延长生存时间（>70天）。其次,CD19-CAR iT细胞在体内接受到CD19抗原刺激后能够快速增殖,并且可被大量激活（CD44+CD62L-）,从侧面印证了 CD19-CARiT细胞功能的有效性。以上结果说明CD19-CAR iT细胞可以有效清除B淋巴瘤细胞,也验证了由多能干细胞诱导再生的iT细胞可以用于制备CAR-T细胞,这为T细胞疗法的新细胞来源提供了技术参考。与此同时,髓系细胞,特别是粒细胞和单核-巨噬细胞,是天然免疫系统重要成员,在吞噬、杀菌和抗病原体感染中发挥关键作用。因此,再生有功能的髓系细胞对移植和化疗后的抗感染治疗具有重要的临床意义。本研究发现,Runx1-Hoxa10二因子条件性诱导表达的mES细胞系（iR10 mESCs细胞系）可诱导分化获得可移植的造血细胞种子,移植后体内再生出髓系细胞,包括粒细胞和单核-巨噬细胞。具体而言,首先通过形成拟胚体（Embryoid bodies,EBs）的方式模拟胚胎发育早期阶段,随后通过诱导Runx1和Hoxa10的表达和添加特定造血细胞因子进行培养获得诱导型生血内皮细胞（iHECs,CD31+CD41lowCD45-c-Kit+CD201hi）。生成的iHECs再和OP9-DL1基质细胞共培养获得诱导型造血祖细胞（induced hematopoietic progenitor cells,iHPCs）,这些 iHPCs 植入半致死辐照后的Rag1-/-小鼠后成功再生髓系细胞（CD11b+）。PCR测序结果证明体内再生的髓系细胞确实插入了目的基因Runx1和Hoxa10。此外,在骨髓和脾脏组织中均检测到再生的髓系细胞,包括粒细胞（CD11b+Gr1+）、单核细胞（CD11b+Gr1-F4/80-）和巨噬细胞（CD11b+F4/80+）。最后,iHPCs在移植入半致死辐照后的野生型受体鼠后也成功再生髓系细胞。结合再生髓系细胞的功能实验结果,本研究将为再生人髓系细胞提供技术参考,也有望为临床上抗感染细胞疗法等提供新的细胞来源。
孙莹莹[6]（2020）在《髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究》文中认为目的通过研究SAA患者mDC内cofilin 1表达水平,及其对mDC和下游效应T淋巴细胞的影响,探索cofilin 1在SAA免疫发病中的作用,为完善SAA免疫发病机制,寻求新的治疗靶点提供理论依据。方法一,通过流式细胞术、WB方法检测30例SAA患者（初治15例、完全缓解15例）和15名健康对照者mDC内cofilin 1蛋白表达水平,并将SAA患者cofilin 1水平与其血常规、免疫指标作相关性分析。通过q RT-PCR方法检测三组患者mDC内cofilin 1的m RNA相对表达水平。二,应用RNAi技术敲低SAA患者mDC内cofilin 1表达水平,对敲低前后的mDC进行如下检测:CCK-8检测细胞增殖、流式细胞术检测凋亡、流式细胞术和免疫荧光方法检测吞噬能力、Transwell实验检测细胞迁移能力、流式细胞术检测共刺激分子CD80和CD86表达水平,免疫荧光检测F-actin。三,将cofilin 1敲低前后的SAA患者mDC与CD4+T淋巴细胞共培养,流式细胞术检测各组共培养上清Th1和Th2相关细胞因子的表达差异,流式细胞术检测Treg细胞foxp3的表达水平。四,将cofilin 1敲低前后的SAA患者mDC与CD8+T淋巴细胞共培养,CFSE检测各组CD8+T淋巴细胞的增殖状况差异,流式细胞术检测其分泌穿孔素、颗粒酶B水平变化。结果一,流式检测初治SAA患者mDC内cofilin 1水平[（70.37±22.70）%]明显高于健康对照者[（39.65±23.43）%,P=0.006]及SAA完全缓解者[（43.97±21.23）%,P=0.002],完全缓解组及健康对照组之间无统计学差异。SAA患者mDC内cofilin1水平,与患者的白细胞计数显着负相关（r=-0.57,P=0.0026）,与中性粒细胞绝对值显着负相关（r=-0.49,P=0.0134）,与血小板计数显着负相关（r=-0.57,P=0.0028）,与血红蛋白水平显着负相关（r=-0.47,P=0.0192）,与网织红细胞绝对值显着负相关（r=-0.4089,P=0.0424）;与CD4+/CD8+比值显着负相关（r=-0.62,P=0.0010）,与IL-2浓度显着正相关（r=0.56,P=0.0037）,与IFN-γ浓度显着正相关（r=0.56,P=0.0037）。WB检测显示SAA初治患者mDC内cofilin 1表达水平高于SAA完全缓解者及健康对照者。q RT-PCR检测提示SAA初治组患者骨髓培养mDC内cofilin 1的m RNA相对表达量（9.13±10.32）显着高于完全缓解组（2.91±3.08,P=0.049）和健康对照组（1.74±1.70,P=0.020）。二,经q RT-PCR和WB验证成功敲低mDC中cofilin 1水平,蛋白敲低水平为31.6%。应用流式细胞术检测mDC吞噬功能显示敲低组显着低于阴性转染组[（22.64±12.53）%vs（40.07±11.90）%,P=0.000],免疫荧光实验支持上述结果。Transwell检测mDC迁移功能结果示cofilin 1敲低组显着低于阴性转染组（45.08±31.98 vs 67.75±38.07,P=0.044）。流式细胞术检测mDC表面CD86表达水平示敲低组显着低于阴性转染组[（73.80±17.18）%vs（77.26±14.39）%,P=0.034]。Cofilin 1敲低组与阴性转染组之间mDC增殖、凋亡、CD80表达水平无统计学差异。免疫荧光检测结果显示cofilin 1敲低组F-actin含量增高,细胞突起密度增加,发生明显的重构。三,流式细胞术检测mDC与CD4+T淋巴细胞共培养体系中CD4+T淋巴细胞分泌Th1相关细胞因子水平:与阴性转染组相比,cofilin 1敲低组IL-2浓度降低[（179.48±180.52）pg/ml vs（216.32±203.24）pg/ml,P=0.024],TNF-α浓度降低[（178.08±146.00）pg/ml vs（232.48±157.75）pg/ml,P=0.017],IFN-γ浓度降低[（2499.71±2051.73）pg/ml vs（3020.96±2340.99）pg/ml,P=0.023];Th2相关细胞因子仅IL-6浓度降低（357.19±237.02）pg/ml vs（435.74±325.01）pg/ml,P=0.047],IL-4和IL-10浓度无差异。Cofilin 1敲低前后共培养体系Treg表达foxp3水平无差异。四,CFSE检测mDC与CD8+T淋巴细胞共培养体系中CD8+T淋巴细胞增殖,结果显示cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞CFSE平均荧光强度为显着高于阴性转染组（1610313.97±1182187.85 vs 1107368.41±901731.27,P=0.028）。流式细胞术检测cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞分泌穿孔素显着低于阴性转染组[（29.39±15.51）%vs（31.71±14.99）%,P=0.023],cofilin 1敲低组CD8+T淋巴细胞分泌颗粒酶B显着低于阴性转染组[（15.49±10.89）%vs（23.35±10.56）%,P=0.019]。结论一,初治SAA患者mDC内cofilin 1蛋白水平高于完全缓解者和健康对照者。SAA患者mDC内cofilin 1水平和患者的免疫状态、疾病严重程度密切相关,cofilin 1水平越高,免疫紊乱越严重,病情越重。q RT-PCR检测发现cofilin 1m RNA升高,提示cofilin 1在转录水平即升高。二,经RNAi技术敲低SAA患者mDC内cofilin 1,可通过F-actin重构,降低mDC吞噬、迁移功能以及表面共刺激分子CD86的表达水平。对mDC增殖、凋亡、CD80表达无影响。三,Cofilin 1能够增加SAA患者mDC刺激CD4+T淋巴细胞分泌Th1相关细胞因子（IL-2、TNF-α、IFN-γ）和Th2相关细胞因子（IL-6）的能力,以Th1为着。对Treg表达Foxp3能力无影响。四,Cofilin 1能够增加SAA患者mDC刺激CD8+T淋巴细胞增殖和分泌穿孔素、颗粒酶B的能力。五,SAA患者中cofilin 1表达水平或许可以作为SAA诊断和评价的新指标,有望成为SAA治疗的新靶点。
王超雨[7]（2019）在《新型全人源化CD47单抗抗白血病效应及调控CD47表达的机制研究》文中研究表明研究目的:急性髓细胞白血病（AML,Acute myeloid leukemia）是急性白血病中最常见的一种疾病类型,发病率随着年龄的增加而增加。虽然有些患者对于化疗很敏感,但是由于AML高度异质性以及老年患者合并症的存在导致多数患者长期生存偏差。AML患者难治/复发的根源在于患者体内存在白血病干细胞或者微小残留病灶,控制甚至治愈AML的途径应该是清除患者体内白血病干细胞。因此,临床迫切期望高效低毒副作用的新药出现,为临床医师的临床用药选择提供更多的帮助。CD47,也称为整合素相关蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,分子量大小约为50kDa,是广泛表达于各种细胞膜表面的跨膜蛋白。CD47可以与信号调节蛋白α（SIRPα,signal regulatory proteinα）、血小板反应蛋白1（TSP-1,thrombospondin-1）、TSP-2结合介导许多细胞功能,包括白细胞黏附和迁移、T细胞活化、凋亡和吞噬等。其中CD47与SIRPα结合介导的抑制吞噬细胞吞噬活性尤为重要。CD47免疫检查点抑制剂（CD47靶点单克隆抗体）可以阻断CD47与SIRPα的结合,抑制性信号被解除,可以重新激活吞噬细胞功能,吞噬消除恶性或死亡细胞。既往研究已经初步证实,在多种肿瘤中,CD47靶点单克隆抗体或者SIRPα靶点单克隆抗体均可以发挥很好地抗肿瘤效应。众多研究发现CD47普遍高表达于各种恶性肿瘤细胞,但是很少有研究探究何种分子机制导致CD47异常高表达。本研究旨在探讨国产CD47靶点单克隆抗体体内外抗AML效应,并初步探讨导致CD47异常高表达的分子生物学机制,为改善AML治疗效果提供参考依据。研究方法:利用流式法检测21例临床确诊为AML患者和多种AML细胞系CD47表达水平。提取小鼠骨髓来源单核细胞和人外周血来源单核细胞经体外定向诱导分化为巨噬细胞。利用免疫荧光法和流式法检测国产CD47单抗增强巨噬细胞体外吞噬效应的现象,利用Annexin V/PI法检测国产CD47单抗对于AML细胞凋亡的影响,利用流式法检测国产CD47单抗对于AML细胞增殖的影响。选用NOG重度免疫缺陷小鼠作为荷瘤小鼠,指数期增长的U937经尾静脉注射构建AML模型,腹腔注射用药探究体内抗AML效应。通过Western blot和PCR方法,初步探究导致AML细胞高表达CD47的机制。研究结果:与正常骨髓细胞相比较,AML患者和细胞系普遍高表达CD47。本研究随机选取的21例患者中,所有患者的CD47表达量均高于正常对照组,其中17例CD47的表达量高于正常组的2倍。健康对照组MFI为628.3（范围为446-884）,AML组MFI为3430.6（范围为952-9310）。与IgG4相比,国产CD47单抗处理细胞后,0H、24H、48H和72H细胞增殖数并没有降低,Annexin V/PI法检测细胞凋亡率也并没有增多。流式法发现3种国产CD47单克隆抗体均可以很好地结合AML细胞,进一步研究发现国产CD47单克隆抗体可以竞争性拮抗原研CD47单克隆抗体的结合位点,为未来临床药物的推广应用提供了良好的理论基础。体外实验发现:对于高表达CD47的细胞系,国产CD47单抗可以增强巨噬细胞对此类细胞的吞噬清除,而对于低表达CD47的细胞系则无此效应。国产CD47单抗可以促进巨噬细胞对于原代AML细胞的吞噬消除。体内实验同样可以发现国产CD47单抗可以显着延长小鼠生存期。通过Western blot和PCR法,我们初步探讨了一下导致AML细胞表面高表达CD47的可能机制,令人欣喜的是,我们发现缺氧诱导因子1与CD47的过表达存在明显的相关性。研究结论:国产CD47靶点单克隆抗体可以通过阻断CD47/SIRPα信号通路重新激活巨噬细胞功能,增强巨噬细胞对AML细胞的吞噬清除。另外本研究初步发现缺氧诱导因子可以调控CD47的表达。
袁伦志[8]（2019）在《人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究》文中认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染在全球范围内造成了严重的疾病负担。HBV感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,其感染人肝细胞后能够持续复制,诱发宿主免疫耐受状态、逐步形成慢性化、直接或间接诱导一系列病理生理学变化并造成重症肝炎、肝衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病。目前,虽然预防性疫苗的普及已经在很大程度上控制HBV新发感染率,但是已批准上市的临床药物仍然无法彻底清除病毒,实现功能性治愈。由于HBV的天然宿主人类和猩猩等大型灵长类动物用于研究收到严格的伦理限制,因此发展能够最大限度模拟HBV感染和发病的动物模型成为进一步认识HBV感染发病机制,以及研发和评价新一代抗HBV药物所面临的一项挑战。数十年来,研究人员建立了转基因小鼠、尾静脉高压注射小鼠、旱獭、北京鸭和树鼩等替代模型,然而它们都不能完全模拟HBV在人类中感染发病的自然史,因此,建立人源化小鼠动物模型,特别是人肝和人免疫系统双嵌合的人源化小鼠动物模型,用于支持HBV感染发病相关研究具有相当的重要性。然而,目前已有的人源化小鼠动物模型一直存在原代人细胞来源匮乏和体外难以扩增、个体差异大、多种细胞移植不匹配、伦理问题、造模周期长、实验窗口期短和难以模拟HBV感染相关的终末期肝脏疾病等限制。因此,建立一种方便易用的、能够支持HBV感染发病研究的新型人源化小鼠动物模型对于进一步推进HBV相关基础研究和治疗策略的发展十分必要。本论文中,我们利用临床分离的健康人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）在免疫缺陷小鼠体内同时重建了同源的人源肝脏和免疫系统,并将此种双嵌合人源化小鼠用于乙肝病毒感染及相关病理生理学研究。我们对乙肝病毒的生物学特征、流行病学、感染自然史、相关肝脏疾病、天然宿主动物、感染细胞和动物模型等方面进行综述研究,基于前期研究和对最新研究成果的考察,我们发现hBMSCs具有重建人类肝脏和免疫系统的巨大的潜力,并选择其作为我们构建新型双嵌合人源化小鼠模型的细胞材料。我们使用hBMSCs移植暴发性肝衰竭免疫缺陷FRGS小鼠,发现其能够在小鼠体内迅速转分化为具有活性的人肝细胞和多种人免疫细胞,同时证明暴发性肝衰竭的肝脏微环境是驱动hBMSCs在免疫缺陷FRGS小鼠体内大量快速转分化为人源肝细胞和免疫细胞的重要驱动因素。我们在hBMSCs移植的免疫缺陷FRGS小鼠（hBMSC-FRGS）体内建立了HBV慢性感染,实现A,B,C,D四种常见HBV基因型病毒感染超过50周。我们连续监测了 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内病毒DNA及蛋白水平,证明被HBV感染的小鼠血清内含有具备感染活力的HBV病毒颗粒。我们初步研究了HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内的免疫病理生理学变化,在感染进行和持续和过程中同步分析了小鼠肝内人源免疫细胞、人源细胞因子、肝脏炎症进展和HBV特异性人源抗体水平等指标,证明HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠出现持续的肝脏炎症和免疫耐受状态。我们在HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内观察到一系列的指示肝硬化发生发展的典型性指标,包括:肝硬化血清学指标持续增高、小鼠肝脏组织中肝硬化相关人源基因表达持续上调、小鼠肝脏组织中胶原纤维堆积持续增加、纤维结节生成、肝小叶结构被破环、肝板塌陷、肝脏外表粗糙体积固缩等。综上所述,我们建立了肝脏和免疫系统双重人源化的hBMSC-FRGS小鼠模型,将其用于HBV感染和相关免疫病理生理学研究,并通过长期观察发现HBV感染后小鼠产生肝脏炎症并且逐步发展为典型的肝硬化。
余泽前[9]（2018）在《胰腺癌来源的外泌体在肝转移中的作用及其机制研究》文中提出目的提取并纯化具有同一亲本不同转移潜能胰腺癌细胞来源的外泌体,探讨高转移潜能胰腺癌细胞来源的外泌体在体外促进低转移潜能胰腺癌细胞侵袭与转移的影响;建立小鼠胰腺癌肝脏预转移小生境（Pre-Metastatic Niche,PMN）及原位移植瘤动物模型,探讨胰腺癌细胞来源的外泌体诱导肝脏预转移小生境及在体内促进肝转移过程中的细胞及分子机制;筛选胰腺癌肝转移相关蛋白,为胰腺癌的侵袭与转移提供理论基础以及为将来胰腺癌的诊断与治疗提供新的靶标。方法采用超高速离心法联合密度梯度离心法提取并纯化胰腺癌细胞来源的外泌体,采用投射电镜及Western Blot实验对外泌体的形态及结构蛋白进行鉴定,并应用BCA法测定两种细胞来源外泌体的蛋白质浓度;在体外应用MTT粘附实验、划痕实验、Transwell侵袭实验及以及Western Blot实验观察高转移潜能胰腺癌细胞来源的外泌体促进低转移潜能胰腺癌细胞侵袭与转移的影响;C57BL/6小鼠尾静脉注射两种细胞来源的外泌体,采用共聚焦显微镜、免疫荧光、Western Blot实验以及流式细胞实验比较两种细胞外泌体在小鼠体内的分布情况及诱导肝脏预转移小生境的影响;对Panc02细胞C57BL/6小鼠胰腺癌原位移植瘤模型进行尾静脉注射两种细胞来源的外泌体,采用H&E染色、免疫组化以及Masson染色观察外泌体在体内促进胰腺癌肝转移的细胞及分子机制;提取两种不同转移潜能细胞来源外泌体的蛋白质,采用iTRAQ定量蛋白质组学技术,鉴定胰腺癌细胞来源外泌体的蛋白质成分,筛选出肝转移相关差异蛋白进行Western Blot实验验证,并对差异蛋白进行生物信息学分析。结果超高速离心法联合密度梯度离心法成功从胰腺癌细胞培养液上清中提取并纯化外泌体,透射电镜观察到两种细胞来源的外泌体呈圆形或杯托形的囊泡状结构,直径集中在50150nm之间,Western Blot实验验证了两种外泌体均表达外泌体结构蛋白CD9,MHC-I,TSG101,Panc02-H7 EXO蛋白浓度高于Panc02 EXO;体外实验结果表明Panc02-H7 EXO容易被Panc02细胞所摄取,并能显着降低Panc02细胞的粘附特性,增加其迁移和侵袭能力,Panc02-H7 EXO可以增加Panc02细胞MMP-9,CXCR4的表达;尾静脉注射24 h后外泌体主要积聚在肺脏、肝脏以及脾脏,较少的分布在脑组织和骨髓中,Panc02-H7 EXO与Panc02 EXO相比更多积聚在肺脏、肝脏和骨髓;Panc02-H7EXO与Panc02 EXO可以动员并募集CD11b+和CD45+造血前体细胞至肝脏微环境,激活α-SMA+的肝星状细胞,诱导肝脏组织Fibronection,S100A8和S100A9表达上调产生肝脏预转移小生境,其中Panc02-H7 EXO效应强于Panc02 EXO;Panc02-H7 EXO与Panc02 EXO在体内促进Panc02细胞的侵袭与转移,募集F4/80+的巨噬细胞、α-SMA+的肝星状细胞以及中细粒细胞积聚在肝脏微环境,并诱导炎症因子Fibronection,S100A8和S100A9在肝脏表达上调及胶原纤维在肝脏组织中沉积,其中Panc02-H7 EXO效应强于Panc02 EXO;通过iTRAQ定量蛋白质组学分析我们共鉴定出4517个外泌体蛋白质,筛选出79个差异蛋白,其中33个蛋白表达上调,46的蛋白表达下调。生物信息学分析显示大多差异蛋白涉及胰腺癌的侵袭与转移,涉及到的主要信号通路为代谢相关的信号通路。结论联合超高速离心法和密度梯度离心法分离并纯化了胰腺癌细胞来源的外泌体简单、有效;高转移潜能胰腺癌来源的外泌体容易被受体细胞摄取,并能显着降低受体细胞的粘附特性,增加了其迁移和侵袭能力;胰腺癌细胞来源的外泌体具有亲器官分布的特征,并且可有效的诱导肝脏炎症和纤维转移微环境的形成;高转移潜能胰腺癌来源的外泌体在体内促进了胰腺癌原位移植瘤的生长、侵袭和转移的发生;采用iTRAQ定量蛋白质组学方法筛选出的转移相关差异蛋白,这些差异蛋白所涉及的分子功能和信号通路可能在胰腺癌的侵袭与转移过程中发挥重要作用,其具体机制及临床价值有待进一步研究。
吴蓓[10]（2018）在《扶正祛毒汤对T-ALL-CR患者CD34+细胞源DC诱导作用研究》文中研究说明目的:本项目主要观察扶正祛毒汤对急性T淋巴细胞白血病完全缓解（Acute T lymphoblastic leukemia Complete Remission,T-ALL-CR）患者 CD34+细胞源树突细胞（Dendritic Cell,DCs）的诱导作用,并且通过激活T细胞+CEM细胞的方式观察T细胞对CEM细胞的杀伤作用,探讨中药复方扶正祛毒汤对急性T淋巴细胞白血病完全缓解期患者DCs免疫功能的影响。方法:1.用扶正祛毒汤以高、中、低不同剂量连续3天于早、中、晚定时灌胃新西兰大白兔,设正常对照组,并于末次灌胃2h后在无菌条件下行心脏取血,采集含药兔血清及正常兔血清以备用。2.在无菌条件下行骨髓穿刺收集T-ALL-CR患者的骨髓,采用Ficoll密度梯度离心获得骨髓单个核细胞,用免疫磁珠分离法获得CD34+细胞,将采集的CD34+细胞加入细胞因子如干细胞生长因子（Stem Cell Factor,SCF）、血小板生成素（Thrombopoietin,TPO）、白细胞介素-3（Interl-eukin-3,IL-3）、FMS 样酪氨酸激酶-3（FMS-like tyrosine kinase-3,Flt-3）共同培养9天以促进CD34+细胞数量的扩增。3.利用自动细胞计数仪将培养的CD34+细胞数量调整至1×106/ml后与第一步中制备的高、中、低不同剂量中药含药兔血清共同培养,此过程需加入细胞因子如干扰素-α（Interferon-α,IFN-α）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、单核-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor,GM-CSF）、白细胞介素-4（Interleukin-4,IL-4）共同培养诱导DCs,实验可分为扶正祛毒汤高剂量+细胞因子组（FQG+XB）、扶正祛毒汤中剂量+细胞因子组（FQZ+XB）、扶正祛毒汤低剂量+细胞因子组（FQD+XB）、细胞因子组（XB）、正常兔血清组（ZC）,予隔日半量更换培养液,利用倒置显微镜进行观察各组诱导培养细胞的形态及数目,细胞培养过程中将细胞用台盼蓝染色后采用细胞计数仪观察各组诱导培养细胞的活力。4.收集培养9天后的细胞,利用流式细胞仪（Flow Cytometry,FCM）检测 DCs 表面特异性抗原 CD 1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达。5.收集从正常人及T-ALL-CR患者外周血分离纯化得到的T细胞,与CD34+细胞来源的DCs以10:1比例放入24孔培养板培养4-5天,将激发后的T细胞与CEM细胞分别以不同效靶比（10:1,20:1,40:1）放入96孔板培养24h,采用MTT法检测实验五组中经过DCs激发后的T细胞对CEM细胞的特异杀伤效应。结果:1.通过倒置显微镜观察发现高、中、低不同剂量中药含药兔血清+细胞因子组与细胞因子组均能诱导生长出具有典型细胞学形态特征的DCs,且总体上中药含药兔血清+细胞因子组培养的DCs细胞形态较单纯细胞因子组典型,数目也更多,但是不同剂量中药含药兔血清+细胞因子组之间并没观察到细胞形态及数目的明显差异,正常兔血清组未观察到典型DCs的生长。2.DCs免疫表型:T-ALL-CR患者骨髓经过分离后的单个核细胞在扶正祛毒汤含药兔血清培养下可诱导出具有DCs特异性免疫表型的细胞。诱导后期,CD1a、CD80、CD83、CD86、HLA-DR在各实验组均有表达,不同剂量含药兔血清+细胞因子组、细胞因子组的表达率高于正常兔血清组,有统计学意义（P<0.05）。3.DCs激发正常人、患者外周血T细胞对CEM细胞的杀伤作用:相同效靶比进行比较时,高、中、低不同剂量含药兔血清+细胞因子组激活正常人及T-ALL-CR患者T细胞对CEM细胞的杀伤率高于细胞因子组和正常兔血清组,有统计学意义（P<0.05）。在相同效靶比不同剂量含药兔血清+细胞因子组激活正常人T细胞对CEM细胞的杀伤率与激活T-ALL-CR患者T细胞对CEM细胞的杀伤率没有统计学差异（P>0.05）。不同效靶比时,比较正常兔血清组、不同浓度剂量含药兔血清+细胞因子组激活T-ALL-CR患者T细胞对CEM细胞的杀伤率,当效靶比为40:1时比10:1及20:1有统计学意义（P<0.05）。相同效靶比进行比较时,同一组别的正常人和患者之间比较杀伤率无统计学差异（P>0.05）。结论:1.扶正祛毒汤含药兔血清能促进T-ALL-CR患者CD34+细胞源DCs的分化与成熟。2.扶正祛毒汤含药兔血清诱导的DCs能激发患者和正常人外周血T细胞发挥对CEM细胞的杀伤作用,具有良好的生物学效应。3.T-ALL-CR患者外周血T细胞具有正常免疫功。
二、外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定（论文提纲范文）
（1）基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胸腺肽的研究进展 |
| 1.1.1 胸腺肽概述 |
| 1.1.2 胸腺肽作用研究 |
| 1.2 免疫系统的研究进展 |
| 1.2.1 免疫系统的组成 |
| 1.2.2 免疫系统的功能 |
| 1.2.3 免疫系统影响因素 |
| 1.2.4 免疫系统与肿瘤发生发展的关系 |
| 1.2.5 造血与免疫系统 |
| 1.3 免疫治疗在结直肠癌治疗中的研究进展 |
| 1.3.1 肿瘤免疫治疗 |
| 1.3.2 免疫治疗在结直肠癌治疗中的应用 |
| 1.4 化疗引起的造血功能障碍研究进展 |
| 1.5 立题背景及意义 |
| 第2章 小牛胸腺肽成分分析研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 CTP分子量测定 |
| 2.3.2 CTP中氨基酸含量的测定 |
| 2.3.3 CTP中核苷酸含量的测定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 分子量测定结果 |
| 2.4.2 氨基酸含量测定结果 |
| 2.4.3 核苷酸含量测定结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 试剂盒和抗体信息 |
| 3.2.4 实验细胞及动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫低下小鼠模型的构建及分组给药 |
| 3.3.2 小鼠样品采集及脏器指数检测 |
| 3.3.3 NK细胞杀伤活性及淋巴细胞转化活性 |
| 3.3.4 小鼠肝脏、脾脏、肾脏病理学检测 |
| 3.3.5 小鼠生化指标测定 |
| 3.3.6 APC小鼠分组给药 |
| 3.3.7 小鼠样品采集及脏器指数、肠道指数检测 |
| 3.3.8 小鼠外周血有核细胞制备、染色及流式测定 |
| 3.3.9 小鼠肠道菌群检测及分析 |
| 3.3.10 小鼠结直肠及脏器组织病理学检查 |
| 3.3.11 小鼠脾脏和肿瘤组织中相关蛋白免疫组化检测 |
| 3.3.12 小鼠生化指标测定 |
| 3.3.13 Western blot分析 |
| 3.3.14 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CTP对免疫低下小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.2 CTP对免疫低下小鼠NK细胞杀伤活性的影响 |
| 3.4.3 CTP对免疫低下小鼠淋巴细胞转化活性的影响 |
| 3.4.4 CTP对免疫低下小鼠脏器组织病理学的影响 |
| 3.4.5 CTP对免疫低下小鼠免疫相关细胞因子的影响 |
| 3.4.6 CTP对 APC小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.7 CTP对 APC小鼠结直肠肿瘤和肠道指数的影响 |
| 3.4.8 CTP对 APC小鼠肿瘤组织病理学的影响 |
| 3.4.9 CTP对 APC小鼠脏器组织病理学的影响 |
| 3.4.10 CTP对 APC小鼠外周血中免疫细胞的影响 |
| 3.4.11 CTP对 APC小鼠脾脏和结直肠肿瘤中免疫相关蛋白的影响 |
| 3.4.12 CTP对 APC小鼠血清和结肠中免疫相关细胞因子的影响 |
| 3.4.13 CTP对 APC小鼠肠道菌群物种组成的影响 |
| 3.4.14 小鼠肠道菌群Alpha多样性分析 |
| 3.4.15 小鼠肠道菌群Beta多样性分析 |
| 3.4.16 小鼠肠道菌群差异性分析 |
| 3.4.17 CTP对 APC小鼠肿瘤组织和脾脏中相关蛋白表达的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 小牛胸腺肽促造血功能活性的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 试剂盒及抗体信息 |
| 4.2.4 实验细胞及动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 K562 细胞和CHRF细胞的铺板及CTP给药 |
| 4.3.2 细胞活性检测 |
| 4.3.3 细胞凋亡检测 |
| 4.3.4 K562 细胞联苯胺染色 |
| 4.3.5 Western blot分析 |
| 4.3.6 造血功能障碍小鼠模型的构建及CTP给药 |
| 4.3.7 样品采集及脏器指数检测 |
| 4.3.8 外周血细胞计数 |
| 4.3.9 小鼠骨髓有核细胞制备,染色及流式细胞术测定 |
| 4.3.10 小鼠骨髓及脏器组织病理学检测 |
| 4.3.11 蛋白质组学分析筛选细胞因子 |
| 4.3.12 小鼠生化指标测定 |
| 4.3.13 Western blot分析 |
| 4.3.14 小鼠骨髓有核细胞制备及给药 |
| 4.3.15 Western blot分析 |
| 4.3.16 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞活性的影响 |
| 4.4.2 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞凋亡的影响 |
| 4.4.3 CTP对K562 细胞分化能力的影响 |
| 4.4.4 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞增殖分化相关蛋白的影响 |
| 4.4.5 CTP对造血功能障碍小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 4.4.6 CTP对造血功能障碍小鼠外周血细胞的影响 |
| 4.4.7 CTP对造血功能障碍小鼠骨髓细胞的影响 |
| 4.4.8 CTP对造血功能障碍小鼠骨髓和脏器组织病理学的影响 |
| 4.4.9 CTP对造血功能障碍小鼠细胞因子的影响 |
| 4.4.10 CTP对造血功能障碍小鼠脾脏中相关通路蛋白的影响 |
| 4.4.11 CTP对小鼠原代骨髓细胞中相关通路蛋白的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论和展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在攻读博士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（2）Hlf标记的胚胎新生造血干细胞的功能及命运研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 造血干细胞前体特征基因的筛选及小鼠构建 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验设计 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.3.1 实验动物 |
| 1.3.2 实验试剂与抗体 |
| 1.3.3 仪器和耗材 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 1.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 1.4.3 流式分析和分选 |
| 1.4.4 实验用溶液配制 |
| 1.5 实验结果 |
| 1.5.1 造血干细胞前体中特异表达基因的筛选 |
| 1.5.2 构建Hlf-tdTomato和Hlf-CrexER小鼠模型 |
| 第二章 HIf表达群体的造血干细胞潜能 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验材料 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 实验试剂与抗体 |
| 2.3.3 仪器和耗材 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 2.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 2.4.3 流式分析和分选 |
| 2.4.4 试剂配制 |
| 2.4.5 免疫组织化学 |
| 2.4.6 OP9-DL1共培养 |
| 2.4.7 孵育产物分析 |
| 2.4.8 尾静脉移植 |
| 2.4.9 移植受体小鼠外周血嵌合检测 |
| 2.4.10 基因型鉴定 |
| 2.4.11 凝胶电泳 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 利用Hlf-tdTomato小鼠进行Hlf基因的表达图谱鉴定 |
| 2.5.2 E10.5时期Hlf-tdTomato小鼠对造血干细胞前体富集检测 |
| 2.5.3 E11时期Hlf-tdTomato小鼠对造血干细胞前体的富集检测 |
| 第三章 表达Hlf的造血干细胞对胚体发育中造血贡献的动力学研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验设计 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.3.1 实验动物 |
| 3.3.2 实验试剂与抗体 |
| 3.3.3 仪器与耗材 |
| 3.4 实验方法 |
| 3.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 3.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 3.4.3 流式分析 |
| 3.4.4 试剂配制 |
| 3.4.5 免疫组织化学 |
| 3.4.6 全胚胎免疫荧光 |
| 3.4.7 外周血5系检测 |
| 3.4.8 小鼠给药方式 |
| 3.4.9 基因型鉴定 |
| 3.4.10 凝胶电泳 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 对新构建Hlf-CrexER遗传谱系示踪小鼠进行表达谱鉴定 |
| 3.5.2 胚胎早期Hlf表达细胞在E10.5、E11.5造血事件中的贡献 |
| 3.5.3 绘制胚胎早期不同时间点Hlf表达细胞对胎肝中造血干细胞贡献的动力学研究 |
| 3.5.4 描绘胚胎早期不同时间点Hlf标记细胞对成体外周血中各血系贡献的动力学特点 |
| 第四章 利用双谱系示踪系统研究胚胎期造血发育 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验设计 |
| 4.3 实验材料 |
| 4.3.1 实验动物 |
| 4.3.2 实验试剂与抗体 |
| 4.3.3 仪器与耗材 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 小鼠胚胎发育节点划分 |
| 4.4.2 小鼠胚胎取材及解离成单细胞 |
| 4.4.3 流式分析 |
| 4.4.4 试剂配制 |
| 4.4.5 外周血各系检测 |
| 4.4.6 基因型鉴定 |
| 4.4.7 凝胶电泳 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 利用双谱系示踪系统小鼠研究Hlf在早期胚胎中的造血贡献 |
| 4.5.2 利用双谱系示踪系统小鼠研究Hlf在胎肝中的造血贡献 |
| 4.5.3 利用双谱系示踪系统小鼠研究Hlf在外周血中的造血贡献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（3）造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 异体造血干细胞输注形成微嵌合并刺激受者外周血T细胞的活化 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 第二章 工程化DCs促进受者局部淋巴结T细胞活化 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 第三章 外周血造血干细胞联合工程化DC抑制肿瘤生长 |
| (一)材料和方法 |
| (二)实验结果 |
| (三)实验讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 综述:米托蒽醌和柔红霉素在AML诱导化疗中的系统性综述和meta分析 |
| 参考文献 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（4）补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 急性淋巴细胞白血病 |
| 1.1.2 慢性淋巴细胞白血病 |
| 1.1.3 急性髓细胞性白血病 |
| 1.1.4 慢性粒细胞白血病 |
| 1.1.5 AML和 CML中的白血病干细胞 |
| 1.2 免疫细胞概述 |
| 1.2.1 T淋巴细胞概述 |
| 1.2.2 B淋巴细胞概述 |
| 1.2.3 自然杀伤细胞概述 |
| 1.2.4 NKT细胞概述 |
| 1.2.5 树突状细胞概述 |
| 1.3 中药与免疫概述 |
| 1.4 补肾回阳方的介绍 |
| 1.5 肾虚型小鼠模型概述 |
| 1.6 新型小分子介绍 |
| 1.7 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验细胞 |
| 2.1.3 试剂和化学药品 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 相关实验试剂的配制 |
| 2.1.5.1 磷酸盐缓冲液(PBS)的配制 |
| 2.1.5.2 ACK裂红液的配制 |
| 2.1.5.3 补肾回阳方的熬制与药液浓缩 |
| 2.1.5.4 细胞因子的配制与储存 |
| 2.1.5.5 其他化学试剂的配制 |
| 2.1.6 中药标准品配制 |
| 2.1.7 细胞完全培养基的配制 |
| 2.2 实验技术路线 |
| 2.3 动物实验 |
| 2.3.1 小鼠肾阳虚模型的建立 |
| 2.3.2 小鼠体征变化的记录 |
| 2.3.3 小鼠外周血的采集 |
| 2.3.4 小鼠外周血血常规的测定 |
| 2.3.5 外周血T淋巴细胞亚群的流式检测 |
| 2.3.6 补肾回阳方给药 |
| 2.3.7 补肾回阳方治疗后样本的采集与检测 |
| 2.3.7.1 摘眼球采血 |
| 2.3.7.2 血细胞分析 |
| 2.3.7.3 外周血T淋巴细胞亚群的检测 |
| 2.3.7.4 心脏采血 |
| 2.3.7.5 脾细胞和骨髓细胞的制备 |
| 2.3.7.6 脾细胞和骨髓细胞的T淋巴细胞亚群检测 |
| 2.3.8 DC细胞的体外诱导培养 |
| 2.3.8.1 分离外周血单核细胞 |
| 2.3.8.2 体外细胞因子诱导培养DC |
| 2.3.8.3 DC细胞的流式鉴定 |
| 2.4 补肾回阳方物质分析 |
| 2.4.1 高效液相色谱条件 |
| 2.4.2 质谱条件 |
| 2.5 新型小分子抗白细胞细胞的筛选 |
| 2.5.1 白血病细胞细胞系复苏 |
| 2.5.2 小分子的作用浓度 |
| 2.6 数据统计方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 肾阳虚模型小鼠的鉴定 |
| 3.1.1 造模后小鼠形态的变化 |
| 3.1.2 外周血血常规的变化 |
| 3.1.3 外周血T淋巴细胞亚群的检测 |
| 3.1.4 结论 |
| 3.2 补肾回阳方对肾阳虚小鼠模型的影响 |
| 3.2.1 补肾回阳方灌胃后小鼠体重的变化 |
| 3.2.2 补肾回阳方对小鼠外周血血象的影响 |
| 3.2.3 补肾回阳方对小鼠CD3~+细胞占比的影响 |
| 3.2.4 补肾回阳方对肾阳虚小鼠CD3-NK1.1~+细胞占比的影响 |
| 3.2.5 补肾回阳方对小鼠CD3+NK1.1+细胞占比的影响 |
| 3.2.6 补肾回阳方治疗后DC细胞的数量变化 |
| 3.2.7 结论 |
| 3.3 补肾回阳方的高效液相色谱实验结果 |
| 3.3.1 补肾回阳方高效液相色谱分析 |
| 3.3.2 补肾回阳方与标准品的高效液相色谱图对比。 |
| 3.4 补肾回阳方液质色谱联用仪分析 |
| 3.4.1 淫羊藿成分分析 |
| 3.4.2 炙甘草成分分析 |
| 3.4.3 干姜成分分析 |
| 3.4.4 肉桂成分分析 |
| 3.4.5 结论 |
| 3.5 抗白血病细胞小分子的筛选 |
| 3.5.1 小分子对32D细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.2 小分子对KG-1细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.3 小分子对THP-1细胞48小时抑制率检测 |
| 3.5.4 小分子对Jurkat细胞48 小时抑制率检测。 |
| 3.5.5 结论 |
| 第四章 讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 硕士研究生期间发表的论文 |
（5）多能干细胞分化再生T细胞的体内抗肿瘤评估及再生可移植髓系细胞研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 多能干细胞分化再生的T细胞体内抗肿瘤评估 |
| 1.1 引言 |
| 1.1.1 癌症细胞免疫疗法概述 |
| 1.1.2 CAR-T细胞免疫疗法概述 |
| 1.1.3 再生T细胞的研究进展 |
| 1.2 实验材料和实验方法 |
| 1.2.1 实验动物 |
| 1.2.2 实验试剂 |
| 1.2.3 实验器材 |
| 1.2.4 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 iR9 mESCs体外定向分化获得造血祖细胞iHPCs |
| 1.3.2 iR9 mESCs来源的iHPCs移植免疫缺陷鼠再生T淋巴细胞 |
| 1.3.3 CD19-CAR iT细胞体内肿瘤杀伤功能验证策略 |
| 1.3.4 CD19-CAR iT可有效清除肿瘤模型鼠外周血中的B淋巴细胞 |
| 1.3.5 CD19-CAR iT可有效消除肿瘤模型鼠的肿瘤负荷 |
| 1.3.6 CD19-CAR iT可有效延长肿瘤模型鼠的生存期 |
| 1.3.7 CD19-CAR iT细胞在小鼠体内显示出增殖和激活能力 |
| 1.4 总结和讨论 |
| 第2章 多能干细胞再生可移植髓系细胞研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.1.1 髓系细胞的发育和调控 |
| 2.1.2 再生髓系细胞的现状和进展 |
| 2.1.3 髓系细胞再生新思路 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验器材 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 iRunx1-P2A-Hoxa10-EGFP mES打靶细胞系(iR10 mESCs)构建成功 |
| 2.3.2 iR10 mESCs体外诱导分化生成造血祖细胞 |
| 2.3.3 基质细胞OP9-DL1较MS5-DL1更能促进造血祖细胞产生 |
| 2.3.4 iR10 mESCs来源iHPCs移植Rag1~(-/-)小鼠能够再生髓系细胞 |
| 2.3.5 受体鼠各组织中能检测到再生髓系细胞 |
| 2.3.6 受体鼠骨髓中检测到再生的髓系祖细胞 |
| 2.3.7 iR10 mESCs来源髓系细胞在体内短期存在 |
| 2.3.8 野生型受体鼠体内再生髓系细胞 |
| 2.4 总结和讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（6）髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、重型再生障碍性贫血患者髓样树突状细胞中cofilin1表达水平研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 试剂与仪器 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 FACS检测SAA患者及健康对照者外周血mDC内cofilin1水平 |
| 1.2.2 SAA患者外周血mDC内cofilin1水平与疾病严重程度及患者免疫状态相关 |
| 1.2.3 mDC体外诱导分化过程的显微镜形态观察 |
| 1.2.4 mDC体外诱导分化效率及分选效率 |
| 1.2.5 WB检测SAA患者及健康对照者mDC内cofilin1水平 |
| 1.2.6 qRT-PCR方法检测SAA患者及健康对照者mDC内cofilin1 mRNA水平 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC增殖凋亡及功能的影响及机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 试剂与仪器 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 mDC体外诱导分化、磁珠分选及纯度检测 |
| 2.2.2 流式细胞术转染效率验证,筛选最适细胞及转染试剂比例 |
| 2.2.3 qRT-PCR检测mRNA水平转染效率 |
| 2.2.4 Western Blot验证转染效果 |
| 2.2.5 CCK-8方法检测cofilin1-siRNA转染前后mDC增殖情况变化 |
| 2.2.6 FACS检测cofilin1-si RNA转染前后mDC凋亡情况变化 |
| 2.2.7 FACS及免疫荧光检测cofilin1-siRNA转染前后mDC吞噬功能变化 |
| 2.2.8 Transwell实验检测cofilin1-siRNA转染前后mDC迁移能力的变化 |
| 2.2.9 FACS检测cofilin1-siRNA转染前后mDC共刺激分子CD80/CD86表达水平变化 |
| 2.2.10 免疫荧光检测cofilin1-siRNA转染前后mDC内F-actin的变化 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC刺激CD4~+T淋巴细胞功能的影响 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 试剂与仪器 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 mDC体外诱导分化、分选、纯度检测 |
| 3.2.2 mDC质粒转染及效果验证 |
| 3.2.3 CD4~+T淋巴细胞分选纯度检测 |
| 3.2.4 mDC与CD4~+T淋巴细胞共培养形态观察 |
| 3.2.5 转染前后mDC刺激CD4~+T淋巴细胞产生细胞因子能力变化 |
| 3.2.6 转染前后mDC刺激Treg细胞Foxp3表达水平变化 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 树突状细胞对CD4~+T淋巴细胞的的影响 |
| 3.3.2 树突状细胞与CD4~+T淋巴细胞之间的相互作用与细胞骨架密切相关 |
| 3.3.3 Cofilin1影响mDC对CD4~+T淋巴细胞的作用 |
| 3.4 小结 |
| 四、重型再生障碍性贫血患者cofilin1对mDC刺激CD8~+T淋巴细胞功能的影响 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 研究对象 |
| 4.1.2 试剂与仪器 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.4 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 mDC体外诱导分化、分选、纯度检测 |
| 4.2.2 mDC质粒转染及效果验证 |
| 4.2.3 CD8~+T淋巴细胞分选纯度检测 |
| 4.2.4 mDC与CD8~+T淋巴细胞共培养形态观察 |
| 4.2.5 CFSE检测转染前后mDC刺激CD8~+T淋巴细胞增殖能力变化 |
| 4.2.6 FACS检测转染前后mDC刺激CD8~+T淋巴细胞杀伤功能变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 获得性再生障碍性贫血发病机制及遗传学异常研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）新型全人源化CD47单抗抗白血病效应及调控CD47表达的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、新型全人源化CD47单克隆抗体阻断CD47-SIRPα信号通路,促进巨噬细胞吞噬AML细胞 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 AML细胞系 |
| 1.1.2 病例对象 |
| 1.1.3 实验小鼠 |
| 1.1.4 巨噬细胞原代细胞来源 |
| 1.1.5 主要实验试剂 |
| 1.1.6 主要实验仪器 |
| 1.1.7 主要实验试剂配制 |
| 1.1.8 细胞培养和冻存方法 |
| 1.1.9 原代巨噬细胞提取和培养 |
| 1.1.10 巨噬细胞吞噬AML的体外实验 |
| 1.1.11 Western Blot(蛋白质印记) |
| 1.1.12 Trizol法提取细胞RNA |
| 1.1.13 RNA逆转录为c DNA |
| 1.1.14 qRT-PCR检测mRNA表达水平 |
| 1.1.15 免疫组化 |
| 1.1.16 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 AML患者白血病细胞上CD47的表达 |
| 1.2.2 AML细胞系上CD47的表达 |
| 1.2.3 CD47表达水平对AML患者预后的影响 |
| 1.2.4 国产新型全人源化CD47单克隆抗体对AML细胞增殖和凋亡的影响 |
| 1.2.5 国产新型全人源化CD47单克隆抗体抗原结合位点 |
| 1.2.6 国产新型全人源化CD47单克隆抗体体外抗AML效应 |
| 1.2.7 AML小鼠模型的构建 |
| 1.2.8 国产新型全人源化CD47单克隆抗体体内抗AML效应 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、AML中调控CD47异常表达的分子机制 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象和材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 乏氧诱导CD47mRNA水平高表达 |
| 2.2.2 乏氧诱导HIF-1α和CD47蛋白质水平高表达 |
| 2.2.3 课题延伸 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 一种新的固有免疫检查点-CD47在肿瘤中的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1. 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 HBV的起源与进化 |
| 1.2 HBV的病毒结构 |
| 1.3 HBV的基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 HBV的感染机制和生命周期 |
| 2. 乙型肝炎病毒感染及其造成的相关肝脏疾病 |
| 2.1 HBV感染的主要宿主 |
| 2.2 HBV的全球流行状况 |
| 2.3 HBV感染的自然历史过程 |
| 2.4 HBV感染慢性化诱发的相关肝脏疾病 |
| 2.5 HBV感染的诊断和治疗 |
| 3. 乙型肝炎病毒感染细胞模型 |
| 3.1 基于人肝癌细胞系的HBV稳定复制细胞系 |
| 3.2 基于原代人肝细胞和原代树鼩肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.3 基于人肝脏祖细胞系HepaRG的HBV感染细胞模型 |
| 3.4 基于受体过表达的人肝癌细胞系的HBV感染细胞模型 |
| 3.5 基于受体过表达的原代猪肝细胞和原代猴肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.6 基于人干细胞分化获得类肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 4. 乙型肝炎病毒感染动物模型 |
| 4.1 灵长类HBV感染模型 |
| 4.2 树鼩HBV感染模型 |
| 4.3 土拨鼠替代模型 |
| 4.4 北京鸭替代模型 |
| 4.5 HBV转基因小鼠 |
| 4.6 基于病毒基因组转染的HBV复制小鼠模型 |
| 4.7 人类肝脏单嵌合小鼠模型支持HBV感染及抗病毒研究 |
| 4.7.1 免疫缺陷小鼠和细胞移植 |
| 4.7.2 uPA缺陷的免疫缺陷小鼠模型 |
| 4.7.3 HSV-tk/NOG小鼠模型 |
| 4.7.4 Fa~(-/-)Rag2~(-/-)IL2rg~(-/-)(FRG)小鼠模型 |
| 4.7.5 FRGS小鼠模型 |
| 4.8 人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型支持HBV相关疾病研究 |
| 4.8.1 AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型 |
| 4.8.2 人肝和人免疫系统双嵌合的FRGN和uPA-NOG小鼠 |
| 4.8.3 A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠 |
| 4.8.4 HIS-Hep-FRGN小鼠 |
| 4.8.5 HIS-HUHEP-uPA/NRG小鼠 |
| 5. 人骨髓间充质干细胞的生物学特性 |
| 5.1 人骨髓间充质干细胞的发现 |
| 5.2 人骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外培养 |
| 5.3 人骨髓间充质干细胞的多向分化分化潜能和免疫调节功能 |
| 5.4 人骨髓间充质干细胞移植治疗暴发性肝衰竭的分子机制 |
| 6. 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 7. 研究中用到的主要仪器、耗材和试剂 |
| 7.1 主要仪器 |
| 7.2 常规耗材 |
| 7.3 生物化学与细胞生物学常规基础试剂 |
| 7.4 定性和定量检测试剂盒 |
| 7.5 实验用主要溶液及培养基配制 |
| 7.6 常规PCR引物 |
| 7.7 常规抗体和荧光素 |
| 7.8 实验动物和细胞 |
| 8. 常规分子生物学及细胞生物学实验方法 |
| 8.1 ELISA/CLEIA检测 |
| 8.2 Western Blot检测 |
| 8.3 细胞免疫荧光实验 |
| 8.4 免疫组化和病理学染色实验 |
| 8.5 常规流式细胞技术 |
| 8.6 常规哺乳动物细胞培养方法 |
| 9. hBMSC-FRGS小鼠模型构建和鉴定 |
| 9.1 hBMSCs分离、传代培养、冻存、复苏和鉴定 |
| 9.2 FHF-FRGS小鼠的构建及hBMSCs移植手术 |
| 9.3 肝脏灌流分离肝内实质细胞和非实质细胞 |
| 9.4 分离鉴定人源细胞及检测相关标志物 |
| 9.5 鉴定人源肝细胞和鼠源肝细胞是否发生融合 |
| 10. HBV感染相关病毒学和病理学检测 |
| 10.1 不同基因型HBV病毒生产与纯化 |
| 10.2 HBV蛋白与核酸检测方法 |
| 10.3 hBMSC-FRGS小鼠人源免疫反应分析 |
| 10.4 肝硬化诊断方法 |
| 11. 数据处理与统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 hBMSCs移植暴发性肝衰竭FRGS小鼠 |
| 12.1 hBMSCs表型鉴定 |
| 12.2 hBMSCs移植拯救FHF-FRGS小鼠免于死亡 |
| 12.3 hBMSC-FRGS小鼠实现人源肝细胞嵌合 |
| 12.4 hBMSC-FRGS小鼠实现多种人源免疫细胞嵌合 |
| 12.6 嵌合肝脏内的人源肝和鼠源肝细胞未发生融合 |
| 12.7 hBMSC-FRGS小鼠长期安全性评估 |
| 12.8 FHF肝脏微环境是hBMSCs转分化的关键驱动因素 |
| 12.9 第一部分小结 |
| 第二部分 hBMSC-FRGS小鼠支持慢性化HBV感染 |
| 13.1 hBMSC-FRGS小鼠支持多种基因型HBV感染 |
| 13.2 hBMSC-FRGS小鼠支持C基因型HBV感染慢性化 |
| 13.3 第二部分小结 |
| 第三部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠免疫病理生理学研究 |
| 14.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠肝人源内免疫细胞变化 |
| 14.2 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内人源细胞因子变化 |
| 14.3 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠发生重症肝炎 |
| 14.4 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠产生特异性针对HBV抗原的T细胞 |
| 14.5 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠血清HBV特异性抗体水平变化 |
| 14.6 第三部分小结 |
| 第四部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠诱发人源肝硬化 |
| 15.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清学肝硬化指标变化 |
| 15.2 HBV感染肝hBMSC-FRGS小鼠组织学肝硬化指标变化 |
| 15.3 肝硬化区域种属特异性鉴定 |
| 15.4 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 16. HBV细胞模型和动物模型的发展历程 |
| 17. 基于间充质干细胞的人类肝脏再生和免疫系统重建 |
| 18. HBV感染慢性化和诱导肝脏疾病发生的关键机制 |
| 19. 新型HBV抗病毒治疗策略与关肝脏疾病的防治措施 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（9）胰腺癌来源的外泌体在肝转移中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 胰腺癌细胞来源外泌体的提取及在体内外促进肝转移的实验研究 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验结果 |
| 第二部分 胰腺癌来源的外泌体iTRAQ定量蛋白组学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 在读博士研究生期间科研成果如下 |
| 致谢 |
（10）扶正祛毒汤对T-ALL-CR患者CD34+细胞源DC诱导作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献研究 |
| 实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 骨髓标本 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要实验试剂的配置 |
| 1.5 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 扶正祛毒汤含药兔血清制备 |
| 2.2 CD34~+细胞提取、扩增 |
| 2.3 DCs的诱导 |
| 2.4 DCs的鉴定 |
| 2.5 外周血T细胞的分离纯化 |
| 2.6 外周血T细胞激发 |
| 2.7 CEM细胞培养 |
| 2.8 激发T细胞对CEM细胞的杀伤作用检测 |
| 2.9 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 CD34~+细胞数量及显微镜下扩增情况 |
| 3.2 DCs形态观察 |
| 3.3 DCs表面抗原表达FCM分析 |
| 3.4 DCs激发同种异体、自体T细胞对CEM细胞的杀伤作用 |
| 讨论与结论 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略词对照表 |
| 附录二 综述 |
| 参考文献 |
| 附录三 致谢 |
| 附录四 个人简介 |
四、外周血造血干细胞体外定向诱导树突状细胞及功能鉴定（论文参考文献）
- [1]基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究[D]. 李兰洲. 吉林大学, 2021(01)
- [2]Hlf标记的胚胎新生造血干细胞的功能及命运研究[D]. 汤万波. 军事科学院, 2021(02)
- [3]造血干细胞微嵌合及工程化树突状细胞促进受者T细胞活化的机制研究[D]. 邓磊. 军事科学院, 2020(01)
- [4]补肾回阳方对肾阳虚小鼠免疫系统的调控及活性单体解析和天然化合物抗白血病模型筛选[D]. 李增政. 昆明理工大学, 2020(05)
- [5]多能干细胞分化再生T细胞的体内抗肿瘤评估及再生可移植髓系细胞研究[D]. 吕萃. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [6]髓样树突状细胞中cofilin 1在重型再生障碍性贫血发病机制中作用的研究[D]. 孙莹莹. 天津医科大学, 2020(06)
- [7]新型全人源化CD47单抗抗白血病效应及调控CD47表达的机制研究[D]. 王超雨. 天津医科大学, 2019(02)
- [8]人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究[D]. 袁伦志. 厦门大学, 2019(08)
- [9]胰腺癌来源的外泌体在肝转移中的作用及其机制研究[D]. 余泽前. 东南大学, 2018(01)
- [10]扶正祛毒汤对T-ALL-CR患者CD34+细胞源DC诱导作用研究[D]. 吴蓓. 贵阳中医学院, 2018(05)